绿色荧光蛋白标记兔BMSCs体外成骨的定量能谱分析

目的观察绿色荧光蛋白( GFP)标记的兔骨髓间充质干细胞( BMSCs)成骨诱导后形态学改变和体外骨生成中矿化钙结节的形成,并结合扫描电镜和X射线能谱分析技术( SEM/EDS)对矿化钙结节元素进行定量能谱分析。方法
　　用携带GFP基因的腺病毒转染兔BMSCs进行示踪标记,并诱导细胞向成骨方向分化,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察成骨诱导后细胞形态改变和矿化钙结节的形成,结合SEM/EDS技术观测矿化钙结节的表面微观结构及其元素构成。结果腺病毒介导GFP基因( Ad-GFP )转染兔 BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,经成骨诱导后细胞形态向成骨方向分化,并形成不透光的矿化钙结节,钙结节茜素红染色见红色矿化结节,SEM下见矿化钙结节散布于细胞中,细胞重叠生长,分泌基质旺盛。 EDS分析显示矿化钙结节主要组成元素与正常骨组织相同,其钙磷比(Ca/P)为1.55,接近正常骨组织钙磷比1.49。结论 Ad-GFP能成功转染并标记兔BMSCs,成骨诱导后BMSCs向成骨方向分化,具备较好的骨生成能力,BMSCs体外矿质化成骨过程与体内基本相同。     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

Ad-hBMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞体外骨生成的实验研究

目的 观察Ad-hBMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外骨生成中钙化斑形成,并对钙化斑元素构成进行研究。方法 用携带hBMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞,通过RT-PCR检测转染后BMSCs hBMP-2基因的表达,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察转染后细胞形态改变和钙化斑的形成,结合扫描电镜和X线能谱分析(SEM/EDS)技术观测钙化斑表面微观形貌及其元素构成。结果RT-PCR检测转染后BMSCs表达hBMP-2目的基因,细胞形态向成骨方向分化,钙结节茜素红染色见红色矿化结节,电镜下见钙化灶点状散布于细胞中,细胞重叠生长,分泌基质旺盛。X射线能谱分析显示其表面为钙、磷沉积物,其钙磷比（Ca/P)为1.53。结论Ad-hBMP-2/GFP能成功转染兔BMSCs,体外诱导BMSCs向成骨方向分化,并具备较好的骨生成能力。     

转基因技术及骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用与展望

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是一类存在骨髓内的非造血干细胞,具有较强的增殖功能及多向分化潜能.在一些细胞因子的诱导下可以向成骨系细胞、内皮细胞、成纤维系细胞、成软骨系细胞等方向分化,近年来已成为生物学和医学的研究热点.而转基因技术是一项目前较为热门的生物科技技术.本文简要介绍了不同基因如骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、软骨源性形态发生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP-1）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、成骨生长肽（osteogenic growth peptide,OGP）等通过转染后对BMSCs增殖、分化的影响及其在骨缺损修复中的应用.     

腺病毒 rhBMP-2转染兔 BMSCs 复合同种异体脱钙骨基质的生物相容性研究

目的：探讨腺病毒重组人骨形态发生蛋白-2（Ad-rhBMP-2）转染兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合同种异体脱钙骨基质（DBM）的生物相容性。方法参照 Urist 方法制得兔同种异体 DBM 材料,免疫组化观察转染后 BMSCs 内 BMP-2表达情况;转染48 h 后复合同种异体 DBM 上,扫描电镜观察细胞生长、贴附情况,MTT 法检测细胞增殖情况。结果腺病毒转染48 h 后,BMSCs 能够表达 BMP-2,扫描电镜可见转染后的细胞在 DBM 上贴附良好并且大量增殖。MTT 检测结果显示,种植于DBM 上的转染后细胞增殖情况正常,与对照组比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论Ad-BMP-2转染 BMSCs 与同种异体DBM 的生物相容性良好。     

组织工程骨表面微观形貌和生物矿化的实验研究

目的：用绿色荧光蛋白( GFP)标记结合扫描电镜和X射线能谱分析( SEM/EDS)技术对组织工程骨的表面微观形貌和生物矿化进行观测,以评价脱钙骨( DBM )支架体外构建组织工程骨的生物性能。方法用重组腺病毒介导GFP基因转染兔骨髓间充质干细胞( BMSCs)进行示踪标记,细胞与DBM复合经成骨诱导后,通过倒置荧光显微镜对细胞生长情况进行即时观察,结合SEM/EDS技术,观测组织工程骨的表面微观形貌和生物矿化。结果在倒置荧光显微镜下见细胞在DBM支架上能较好的黏附、重叠生长和增殖,体外培养至14 d 时,细胞内 GFP 有较高水平瞬时表达。SEM见DBM呈疏松多孔结构,孔隙直径为300~600μm,孔隙率达90%。 SEM下观察组织工程骨,见细胞在DBM网孔内表面贴壁生长,分泌基质旺盛,并可见粗糙的生物矿化物覆盖支架。 EDS显示其表面为钙、磷沉积物,其钙磷比( Ca/P)为1．46。结论 DBM体外构建组织工程骨有非常好的生物性能,GFP标记结合SEM/EDS技术可以作为DBM体外构建组织工程骨较好的评价手段。     

Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞前后生物学特性的研究

目的：对Ad－BMP－2／GFP转染兔骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）前后的生物学特性进行观察。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离获取第10代兔BMSCs,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表达,用携带BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞。分别通过倒置荧光显微镜下观察转染前后细胞形态改变,MTT 法分析转染前后细胞增殖的情况,体外Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节茜素红染色以观察转染前后细胞的成骨分化情况,Western Blot 检测转染前后细胞内目的蛋白表达。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能获取高纯度第10代兔BMSCs ,流式细胞仪检测显示CD44、CD29阳性,CD45阴性。 Ad－BMP－2／GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,细胞形态向成骨方向分化,在短时间内能促进兔BMSCs 的增殖（P＜0．05）,Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阳性,Western Blot显示细胞内稳定表达BMP－2目的蛋白。结论 Ad－BMP－2／GFP能成功转染兔骨髓间充质干细胞并能改变其生物学特性。     

腺病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合DBM修复兔缺血性股骨头坏死的实验研究

摘要： 目的 评价人骨形态发生蛋白（hBMP） -2/骨髓间充质干细胞（BMSCs）/脱钙松质骨（DBM）对兔股骨头坏 死的修复作用, 探索临床治疗股骨头坏死的新途径。方法 髓芯减压联合液氮冰冻法制备兔股骨头坏死模型。将 造模成功兔随机分为 A、 B、 C、 D 4 组(n=12), A 组不植入材料, 为对照组, B、 C、 D 分别植入 DBM、 DBM/BMSCs、 hBMP- 2/BMSCs/DBM。术后 4、 8 及 12 周各组分别处死 4 只, 运用 X 线技术、 大体标本观察、 HE 染色技术评判股骨头坏死 修复情况。结果 X 线示 A 组股骨头塌陷, 无明显成骨; B、 C、 D 组股骨头缺损区有骨再生现象, 但 D 组再生情况明 显优于 B、 C 组。Lane-Sandhu X 线评分 A 组B、 C 组>D 组 （P < 0.05), B 和 C 组差异无统计学意义。结论 hBMP-2/BMSCs/DBM 植入体内后能 够诱导 BMSCs 向成骨方向分化, 对兔股骨头坏死具有较好的修复效果。