M与m-bcr/abl融合基因转录子共表达与 CML患者血小板增多的关系

目的 研究共表达m-bcr/abl融合基因转录子对初诊慢性髓系白血病(CML)患者的巨核细胞形态的影响.方法 分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和巢式PCR检测M和m-bcr/abl融合基因转录子.盲法计数患者骨髓涂片1.0 cm×1.5 cm2面积内巨核细胞数,随机选取20个巨核细胞分类计数并测定成熟期巨核细胞直径;计数产板型巨核细胞产血小板数.结果 107例初诊CML患者M和m-bcr/abl共表达者56例,b3a2型31例,b2a2型25例.共表达m-bcr/abl的b3a2型初诊CML患者血小板数比单表达M-bcr/abl和b2a2型m-bcr/abl( )患者高(P＜0.05).对巨核细胞形态观察,在b3a2和b2a2组,共表达m-bcr/abl和单表达M-bcr/abl的患者骨髓1.0 cm×1.5 cm面积内巨核细胞数、成熟巨核细胞数和直径差异均无统计学意义(P＞0.05);共表达m-bcr/abl的b3a2型患者产板型巨核细胞产板数比单表达M-bcr/abl患者高(P＜0.05);而b2a2型的共表达m-bcr/abl组和单表达M-bcr/abl组1.0 cm × 1.5 cm面积内巨核细胞数、成熟巨核细胞数和直径及产板型巨核细胞产板数差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 共表达m-bcr/abl的b3a2型初诊CML患者血小板数增高是由其巨核细胞产板数多造成的,而与其巨核细胞数、产板型巨核细胞数和直径无关.     

骨髓增生异常综合征P15INK4B基因甲基化及药物去甲基化作用

目的 检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者P15INK4B基因甲基化状况;探讨5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶(decitabine)和三氧化二砷(As2O3)对MDS患者细胞的去甲基化作用.方法 采用限制性内切酶联合PCR方法检测14例MDS患者P15INK4B基因甲基化,选择1例由MDS转化为急性白血病患者的外周血单个核细胞,分组分别加入decitabine和As2O3进行处理,分析甲基化程度变化情况.结论 低危组MDS患者(RCMD)均未发现P15INK4B基因甲基化,4例高危组MDS患者(RAEB)和4例 MDS-AL患者发现P15INK4B基因甲基化.经decitabine和As2O3处理后,MDS患者细胞的甲基化程度均降低50%左右.结论 MDS的发生与P15INK4B基因甲基化密切相关,decitabine和As2O3均对MDS患者细胞高度甲基化的P15INK4B基因具明显去甲基化作用.     

两种方法转染EGFP基因对脐血造血干/祖细胞体外生长影响的比较

目的 探讨两种非病毒载体介导增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染方式对脐血干/祖细胞体外生长的影响.方法 免疫磁珠分选CD34 脐血干/祖细胞,平均分为3组,即未转染EGFP组、阳离子聚合物转染EGFP组和电穿孔转染EGFP组,将各组脐血CD34 细胞接种于人骨髓间充质干细胞(MSCs)构建的二维培养体系中在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,7 d后进行集落形成单位(CFU)实验和高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)实验.并利用荧光显微镜观察转染EGFP的CD34 细胞集落形成,Wright-Giemsa 染色了解其分化情况.结果 阳离子聚合物转染和电穿孔转染都可减少造血干/祖细胞集落形成的数目,且集落的大小也较未转染组小(P＜0.05).电穿孔转染组荧光集落形成的数目多于阳离子聚合物转染组,且所形成的荧光集落更大更亮(P＜0.05).两种转染方式的脐血造血干/祖细胞在体外培养后仍具有多向分化能力.结论 这两种非病毒载体介导EGFP基因转染方式均可造成脐血造血干/祖细胞生物学特性不同程度的损害.但电穿孔转染方式对于造血干/祖细胞体外生长损害较阳离子聚合物转染要小,且转染效率更高,转染基因表达更稳定.     

丹参酮ⅡA对NB4所诱导的人ECV304细胞株促凝活性的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对急性早幼粒细胞性白血病（APL）细胞株NB4诱导的人ECV304细胞株促凝活性的影响。方法①分别用0．5μg／mL TanⅡA、0．3μg／mL ATRA、0．1g／LDMSO、RPMI1640处理培养NB4细胞制成条件培养基TanⅡA-NB4-CM,ATRA-NB4-CM、DMSO-NB4-CM以及RPMI1640-NB4-CM,再分别与ECV304细胞在37℃共同孵育0、4、8、12h,利用复钙时间测定及改良发色底物法,分别测定ECV304细胞裂解液的肿瘤促凝活性（PCA）和组织因子活力（TF：Act）。②ECV304细胞分别与0．5μg／mLTanⅡA及TanⅡA-NB4-CM在37℃共同孵育4、12、24、72、120h,用上述同样方法测定ECV304细胞裂解液的PCA和TF：Act。结果①0．5μg／mLTanⅡA处理NB4细胞24、72、120h的条件培养基能使ECV304细胞PCA增强,ATRA具有相似作用（P〉0．05）。②0．5μg／mL的TanⅡA对0．5μg／mL TanⅡA作用NB4120h的条件培养基（TanⅡA-120h-NB4-CM）促ECV304细胞PCA有抑制作用,其作用强度呈时间依赖性,120h达到高峰,再增加TanⅡA浓度,作用强度不增加;与0．3μg／mL ATRA作用相似。③TanⅡA-120h-NB4-CM能够增加ECV304细胞TF：Act,并随作用时间增加而增强,TanⅡA与ATRA作用相似（P〉0．05）。④0．5μg／mLTanⅡA能够抑制TanⅡA-120h-NB4-CM对ECV304细胞的TF：Act,并随作用时间增加而增强,ATRA具有相似作用（P〉0．05）。结论TanⅡA在诱导NB4细胞分化凋亡的同时,可能通过某种因子增强NB4细胞对ECV304细胞促凝活性和组织因子活力TanⅡA能够有效阻止NB4细胞增强ECV304细胞的促凝活性和组织因子活力,起到保护细胞的作用。     

Bcr／abl特异性RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建特异性的抗慢性髓细胞白血病融合基因bcr／abl mRNA的siRNA真核细胞表达载体，探索RNA干扰(RNAi)分子靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的作用。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列，按照Tusehl设计原则，选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs，shRNA)的DNA序列，并与pTER质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果：构建慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论：抗慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体的构建成功。     

235例急性髓系白血病患者血浆游离DNAFLT3-ITD的检测及临床意义

本研究检测急性髓系白血病（AML）患者外周血血浆游离DNAFLT3内部串联重复序列（internal tandem duplication,ITD）并探讨其临床意义。提取235例AML患者血浆游离DNA并以PCR扩增看家基因globin作为判定标准,通过PCR方法检测FLT3－ITD,并与骨髓或外周血白血病细胞DNA检测结果进行比较。结果表明：235例AML患者中,190例患者血浆游离DNA扩增出globin基因。188倒初诊、复发或难治患者中,血浆游离DNA发生FL33—1TD突变35例（19％,35／188）,与病人白血病细胞DNA检测结果完全一致。47例临床缓解患者中,有2例血浆游离DNA扩增出globin基因并检出FLT3－ITD突变,而其细胞来源DNA均为阴性。2例患者均早期复发。与FLT3－野生型（wt）相比,FLT3－ITD突变患者白细胞计数、CD7、CD56表达等明显升高,CR率降低。结论：AML患者血浆中可以检测出白血病细胞特异性的血浆游离DNA,与直接检测白血病细胞结果一致。对骨髓缓解期病人残留白血病（MRD）的检测,血浆游离DNA具有更高的敏感性。FLT3－ITD的检测对AML患者的预后及疗效判断有重要意义。     

重型再生障碍性贫血免疫抑制治疗疗效预测指标的研究

目的 探索可能用于重型再生障碍性贫血(再障)免疫抑制治疗(IST)疗效预测的指标.方法 收集37例重型再障患者的静脉血标本,20例健康献血员作为正常对照.采用酶联免疫吸附实验检测血浆内白介素-2(IL-2)及干扰素-γ(IFN-γ)水平,采用序列特异引物聚合酶链反应检测HLA-DRB1*15及HLA-DRB1*1501,结合年龄、性别及粒细胞和红细胞膜表面CD55、CD59表达情况等,对各项指标与疗效的关系进行统计分析.结果 治疗前IL-2水平升高者有效率高于水平降低者(66.7% vs 28.6%,P<0.05);治疗前IFN-γ水平升高者有效率高于水平降低者(73.7% vs 25 0%,P<0.05);HLA-DRB1*15阳性者有效率与阴性者差异无统计学意义(62.5% vs 44.4%,P>0.05);HLA-DRB1*1501阳性者与阴性者有效率均为50%;CD55、CD59表达降低者有效率与表达未降低者差异无统计学意义(80.0% vs 40.0%,P>0.05);年龄≤40岁者有效率高于年龄>40岁者(60.0% vs 14.3%,P<0.05);女性患者有效率高于男性患者(62 5% vs 42 9%,P<0 05).结论 重型再障患者治疗前血浆IL-2、IFN-γ水平、性别及年龄可作为IST疗效预测指标,而HLA-DRB1*15、HLA-DRB1*1501及CD55、 CD59在本研究中不具有预测作用.     

青蒿琥酯对人淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞抑制作用及机理的研究

目的 观察青蒿琥酯(ART)对白血病/淋巴瘤细胞株Raji、Jurkat和急性淋巴细胞白血病(ALL)原代细胞的增殖抑制作用,以及ART与长春新碱(VCR)、阿糖胞苷(Ara-C)的细胞毒协同效应,并探讨其作用机制.方法 MTT法观察ART对Raji、Jurkat、ALL原代细胞的增殖抑制效应及ART与VCR、Ara-C的协同效应.Wright-Giemsa染色光镜下及透射电镜观察细胞凋亡的形态变化,Rhodamine-123检测线粒体跨膜电位(MMP)变化,比色法检测细胞内caspase-3浓度变化.结果 ART在体外能显著抑制Raji、Jurket细胞的增殖,对ALL原代细胞亦具有增殖抑制作用.低浓度ART与VCR、Ara-C联合,能增加VCR、Ara-C的细胞毒作用.ART作用后B/T淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞光镜及电镜均表现出凋亡形态学改变,线粒体跨膜电位下降,细胞内caspase-3的表达增加,呈浓度依赖性.与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 ART对淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞具有抑制作用,且与VCR、Ara-C联用具有协同效应,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关.ART有望开发成治疗ALL/淋巴瘤的新药.     

伴染色体三体异常的慢性中性粒细胞白血病1例

慢性中性粒细胞白血病（chronic neutrophilic leukemia,CNL）是一种少见的骨髓增殖性疾病,其主要特点表现为外周血和骨髓中中性粒细胞的过度增生,同时可伴有肝脾肿大,而细胞遗传学和分子生物学检查无Ph染色体及BCR／ABL融合基因。这种疾病迄今为止全世界报道的病例不超过150例,虽然伴有9号染色体三体异常的CNL国外有报道,但国内尚未见报道。我院近期诊断1例伴有9号染色体三体核型异常的CNL,现报告如下。     

丹参酮ⅡA对NB4诱导的人脐静脉内皮细胞促凝活性的影响

目的 探寻丹参酮ⅡA(TanⅡA)对于急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)促凝活性(PCA)的影响.方法 将TanⅡA作用24、72、120 h的NB4细胞条件培养基(NB4-CM)或不同浓度TanⅡA与其对应的120 h NB4-CM共同作用HUVEC,并以ATRA、DMSO和RMPll640作为阳性、阴性和空白对照,收集HUVEC裂解液采用一期凝血法测定其PCA,采用改良发色底物法测定组织因子活性(TF:act).结果 ①TanⅡA作用72、120 h的NB4-CM有一定的升高内皮细胞PCA的作用,以120 hNB4-CM作用最强,作用6 h最明显,1.0 μg/mL的TanII A与0.3 μg/mL ATRA作用相当.②5.0 pg/mL的Tan ⅡA能明显降低其NB4-CM诱导的内皮细胞PCA,与0.3/μg/mL ATRA的差异无统计学意义.<5.0 μg/mL浓度的TanII A无此作用.③TanⅡA-120 h-NB4-CM和ATRA 120 hoNB4-CM均能升高HUVEC的TF:act,6h达峰值,且两者间无差异.TanⅡA 120 h-NB4-CM所诱导的HUVEC的TF:act 12h轻微降低,24 h回复到基础水平,而ATRA 120 h-NB4-CM所诱导的TF:act在6h达峰后,12h即明显下降,24 h亦降至基础水平.④加入1.0μg/mL TanⅡA后.内皮细胞TF活性在各时间点与未加药组无明显差异,而0.3/μg/mL ATRA在6 h可显著抑制其NB4-CM所诱导的内皮细胞TF活性升高,之后各个时间点无明显差异.结论 TanⅡ A在诱导NB4细胞分化过程中的条件培养基能升高人脐静脉内皮细胞PCA和TF活性,加入适当浓度的TanⅡA可降低这种作用;这些作用与ATRA作用相当.