蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。     

肌氨肽苷制备工艺及其病毒去除方法的验证

目的研究肌氨肽苷制备工艺并对超滤法去除病毒工艺进行验证。方法以家兔心脏和肌肉为原料,制得肌氨肽苷原液。并以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用截留相对分子质量为10 000的超滤器在进压0.12MPa、回流压0.05 MPa和进压0.20 MPa、回流压0.12 MPa条件下去除肌氨肽苷原液中病毒的效果,并以牛血清白蛋白为对照品,20%磺基水杨酸作为指示剂的条件下,对超滤膜的完整性进行验证。结果滤过液中未检测出PPV,经过盲传3代,也未发现特异性细胞病变;磺基水杨酸检测未变浑浊,表明膜完整性好,超滤设备可用。结论制备肌氨肽苷的方法可行,且所采用的超滤法去除PPV是1种有效去除病毒的方法。     

核糖核酸Ⅱ制备及其病毒灭活工艺的验证

目的从牛胰脏制备核糖核酸Ⅱ(RNAⅡ),对巴氏灭活法灭活病毒工艺进行验证。方法以苯酚、氯仿抽提法制备,以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用巴氏灭活法(60℃,10h)灭活RNAⅡ原液中病毒的效果,用纯度、A260/A280比值、紫外特征峰、完整性、含量变化考察灭活前后制剂变化。结果制备了纯度和活性均较好的RNAⅡ,PPV滴度为7.7logTCID50/0.1mL时灭活液中未检测出PPV,经盲传3代,亦未发现特异性细胞病变,灭活前后制剂无质的变化。结论可以现行方法从牛胰脏制备较高纯度RNAⅡ,巴氏法能对RNAⅡ溶液作有效的病毒灭活处理。     

一种迅捷、经济及高效回收DNA片段方法的建立

目的:建立一种迅捷、经济、高效的从凝胶中回收DNA的方法。方法:以二氯二甲基硅烷硅化晴纶纱,以硅化的晴纶纱作为过滤垫层,冻融处理凝胶,离心收集液体,计算不同硅化晴纶纱厚度、不同冻融时间、不同离心力、不同离心时间和不同DN片段长度的DNA回收率。结果:用硅化晴纶纱从凝胶中回收DNA时,0.5～2.0 mm硅化晴纶纱厚度DNA片段回收率均在85%左右,提示不同硅化晴纶纱厚度对DNA片段回收率影响较小;冻融时间在30 min 前,随着冻融时间延长,回收率上升明显,至30 min 回收率达85%,再增加冻融时间回收率变化不显著,提示冻融时间对回收率影响较大,冻融时间应为1 h;在5 000 r•min^-1前,随着离心力增加,回收率上升明显,至5 000 r•min^-1回收率达85%,再增加转速,回收率有略微上升,提示离心力对回收率影响较大,离心力应超过10 000 r•min^-1 (约合10 000 g);以10 000 r•min^-1离心,30 min前,离心时间对回收率影响较大,至30 min时,回收率达85%,增加离心时间,回收率不再增加; 250～2 000 bp 长度DNA片段,回收率为80.7%～88.4%,即使100 bp小片段回收率也能达到76%以上,表明片段大小对回收率影响较小,说明本方法的有效性。结论: 硅化晴纶纱厚度0.5～2.0 mm,冻融时间≥1 h,离心力≥10 000 g,离心时间30 min DNA回收率较高;硅化晴纶纱法可以高效地从电泳凝胶中回收目的DNA片段。     

牛胰脏RNAⅡ的制备

目的：改进从牛胰脏制备RNAⅡ的方法,以降低成本,减少污染排放,提高产品的质量和收率。方法：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法,替代传统方法的大剂量苯酚多次萃取法从牛胰脏提取RNAⅡ。结果：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法制备的RNAⅡ,制剂A₂₆₀/A₂₃₀、A₂₆₀/ A₂₈₀的比值分别达到 2.1和 1.9以上,传统工艺为1.44和1.63;DNA含量控制在 2%以下,传统工艺为6.2%;有机试剂消耗降低明显,由传统工艺的18 000　mL苯酚•kg^-1牛胰脏降低到600和300 mL氯仿•kg^-1牛胰脏;成本由原来的253元•g^-1胰脏核糖核酸降到11~14元•g^-1牛胰脏核糖核酸。结论：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法制备的RNAⅡ中蛋白、多糖含量较低,纯度较传统方法有较大提高;该方法可减少有机试剂用量,减少污染排放,使生产成本大幅度下降;本工艺适合大规模生产RNAⅡ。