鉴定载脂蛋白M基因敲除小鼠的实时荧光定量PCR法的建立

目的建立新型的载脂蛋白M(apolipoprotein M,apo M)基因敲除小鼠的鉴定方法。方法根据荧光PCR原理,分别设计野生型和敲除型apo M基因的引物和探针,并通过6-羧基荧光素(FAM)和3H-吲哚菁染料(CY5)双荧光通道的扩增曲线判断小鼠的基因型。结果野生型小鼠仅在FAM通道有扩增曲线,敲除型小鼠仅在CY5通道有扩增曲线,杂合型小鼠则在FAM及CY5通道均有扩增曲线。结论建立的实时荧光定量PCR法经济、快速、简单、准确、易判断,适用于小鼠apo M基因型的鉴定。     

双重实时荧光定量 PCR 检测人维生素 D 受体的方法学构建

目的 建立单管检测人维生素 D 受体（VDR）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应 （dual real-time PCR） 的方法。方法 以 GAPDH 基因为内参, 采用 Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物及 TaqMan 探针, 进行 PCR 扩增检测 VDR 基因。将 VDR 及 GAPDH 扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒, 作为定量检测基因表达的标准品, 并用于分析该方法的灵敏度和重复性。结果 PCR 扩增产物经测序分析证实为 VDR 及 GAPDH 特异性片段; 该方法检测 VDR 与 GAPDH 灵敏度达 40 拷贝/μL; 线性范围为 4.00×101～4.00×105 拷贝/μL; 决定系数 R2分别为 0.998、 0.999; 扩增效率 E 分别为 96.10%、 85.15%; 批内变异系数（CV）分别为 0.09%~ 1.21%、 0.35%~0.88%; 批间 CV 分别为 0.17%~0.51%、 0.51%~2.46%。结论 成功建立了单管检测人 VDR 及 GAPDH 的双重实时荧光定量 PCR 方法, 且该方法特异性好、 灵敏度高、 可快速高通量检测 VDR 的相对表达量, 有效缩短时间, 减小实验误差。     

人脐静脉内皮细胞 1-磷酸鞘氨醇受体鉴定及其应用探讨

摘要： 目的 鉴定人脐静脉内皮融合细胞株 EA.hy926 和人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） CRL-1730 1-磷酸鞘氨醇受体 （S1PR） 亚型和胞浆中 C-myc 及 His 标签蛋白的表达情况, 为研究载脂蛋白 M （ApoM） -1-磷酸鞘氨醇轴 （ApoMS1P 轴） 的功能提供参考。方法 体外培养 EA.hy926 及 CRL-1730 至细胞密度达到 60%～70%时, 采用细胞免疫荧光技术鉴定内皮细胞标志凝血八因子（FⅧ）、 ApoM、 S1PR1~S1PR5、 C-myc 和 His 标签蛋白。结果 （1）两种细胞均表达 FⅧ和 ApoM, FⅧ在 CRL-1730 中呈散在颗粒状分布, 在 EA.hy926 中呈均匀分布。（2）两种细胞均主要表达 S1PR1, 少量表达 S1PR2 和 S1PR3, 不表达 S1PR4 和 S1PR5。（3）两种细胞胞浆中均有 C-myc 和 His 标签蛋白的表达。结论 两种细胞都具有内皮细胞的特性; 因其自身表达 ApoM、 C-myc 和 His 标签蛋白, 在应用这两种细胞研究 ApoM-S1P 轴的功能时, 不适合选用带有 C-myc 和 （或） His 标签的重组 ApoM 蛋白。     

双重荧光实时 PCR 法鉴定 SRBⅠ基因敲除小鼠

目的 建立一种双重荧光实时 PCR 鉴定 B 族Ⅰ型清道夫受体（SRBⅠ）基因敲除小鼠的方法。方法 提取小鼠尾尖 DNA, 应用自行设计的鉴定野生型和敲除型 SRBⅠ基因的引物和探针, 经 PCR 扩增后, 在 FAM 通道及CY5 通道判断小鼠基因型。同时应用基因测序技术对结果进行验证, 并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果 仅在 FAM 通道出现典型 S 型扩增曲线的为 SRBⅠ基因野生型小鼠, 仅在 CY5 通道出现典型 S 型扩增曲线的为 SRBⅠ基因敲除型小鼠, 在两个通道都出现典型 S 型扩增曲线的为 SRBⅠ基因杂合型小鼠。结果与 DNA测序法吻合, 检测野生型和突变型的灵敏度均达 4×101拷贝/μL。结论 新方法简单、 快速、 准确, 适用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。     

基于SKP-SCs来源的胞外囊泡构建的组织工程神经移植物的生物安全性评价

目的 ：评价基于皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors, SKPs)分化成的施万细胞(Schwann cells, SCs来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)构建的组织工程神经移植物(tissue engineered nerve graft, TENG)的生物安全性。方法：将SKP-SCs来源的EVs(SKP-SC-EVs)注射至带有3根纤维支架的壳聚糖导管中制备成TENGs,修复比格犬坐骨神经40 mm缺损。术后6个月,取心、肝、脾、肺、肾、脑,通过HE染色进行形态学观察,并收集血液进行血液常规和生化指标分析,包括：白细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶和血糖等。结果：形态学分析显示TENGs组比格犬的各脏器组织结构清晰,与自体移植组、壳聚糖导管组相比,各项血液指标差异均无统计学意义(均P>0.05),且未见毒性反应改变。结论:基于SKP-SC-EVs构建的TENGs植入比格犬体内具有良好的生物安全性,为临床应用TENGs治疗周围神经损伤提供安全性数据支持。     

乳腺癌中ApoM差异表达及其对HER2阳性且HR阳性乳腺癌细胞株的生物学影响

目的 探讨载脂蛋白M(ApoM)在乳腺癌中差异表达及其对人表皮生长因子受体2(HER2)阳性且激素受体(HR)阳性的乳腺癌细胞株BT-474和ZR-75-1的生物学影响.方法 检测55例乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中ApoM表达水平.应用慢病毒载体构建ApoM过表达体系并转染HER2阳性且HR阳性的乳腺癌细胞株BT-47...     

载脂蛋白M对肾癌细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用

目的:研究人载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)对肾透明细胞癌细胞株(ACHN、769-P和786-O)增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法:采用装载人ApoM基因的慢病毒和阴性对照组慢病毒分别感染肾癌细胞株,建立ApoM过表达组(ApoM-OE组)和阴性对照组(NC组)细胞模型.应用CCK-8增殖实验...     

快肌与慢肌失神经支配后的形态学变化

目的:探讨快肌(胫前肌)与慢肌(比目鱼肌)在失神经支配过程中的形态学差异。方法:本研究拟采用大鼠坐骨神经离断模型,通过组织病理学系统分析失神经支配过程中胫前肌与比目鱼肌在形态学方面的变化。结果:在坐骨神经损伤后不同时间点,将比目鱼肌的萎缩程度与胫前肌相比,显示比目鱼肌的萎缩程度较胫前肌严重,主要表现在比目鱼肌的肌肉湿重比较小、肌纤维截面积比率较低、超微结构较不完整、运动终板破损较严重。结论:失神经支配后慢肌萎缩程度较快肌严重。     

基于SKP-SCs来源胞外囊泡构建的神经移植物桥接周围神经缺损的生物安全性评价

目的：评价基于皮肤源性前体细胞（skin-derived precursors,SKPs）分化的施万细胞（Schwann cells,SCs来源的胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）构建的神经移植物用于修复周围神经缺损的生物安全性。方法：构建大鼠坐骨神经离断模型，将基质胶装载的SKP-SC-EVs注射至硅胶管制备含囊泡神经移植物（EV-NG），修复坐骨神经损伤。观察术后大鼠运动状态，12周后收集血液进行血常规和生化指标分析，取心、肝、脾、肺、肾、脑组织切片通过HE染色进行病理组织学分析。结果：病理检查显示各组大鼠各重要脏器组织结构清晰，血常规和生化指标均在正常参考范围内，与假手术组比较，EV-NG组与假手术组的差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：装载SKP-SC-EVs的神经移植物具有良好的生物安全性，为临床治疗周围神经缺损提供安全性依据。