急性鸭乙型肝炎病毒感染病毒清除机理研究

目的 :进一步阐明嗜肝病毒自然感染过程中病毒清除机理。方法 :7只 2～ 3月龄成年重庆麻鸭静脉接种 10～ 2 0mlDHBV阳性血清 (5× 10 8～ 1× 10 9genome) ,接种后每周采血检测外周血中DHBVDNA、DHBsAg和特异抗体的产生 ;感染后第10、35天分离外周血单个核细胞用于抗原特异细胞增殖实验 ;第 5、30、6 0天取肝组织标本进行DHBVDNASouthern杂交、DHB sAg免疫组化及肝组织病理检测。结果 :DHBV感染成年鸭在 1～ 2w潜伏期后出现急性、一过性感染 ,感染高峰期肝内存在多拷贝的DHBV所有复制中间体形式 ,包括cccDNA。进一步分析显示病毒血症的消失是在快速抗原特异细胞增殖反应和高滴度特异抗体产生之后 ;与此同时 ,整个急性感染期间 ,肝细胞并无明显的损害。结论 :非细胞直接损伤机制在嗜肝病毒清除过程中发挥了重要作用。     

顺铂通过CREB1诱导乙肝病毒再激活的实验研究

目的：探索顺铂诱导乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）再激活的机制。方法：将稳定表达HBV的肝癌细胞系Hep－AD38分为2组,即磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）对照组及顺铂（Cisplatin）处理组,分别检测cAMP应答元件结合蛋白质-1（cAMP responsive element binding protein 1,CREB1）、乙肝病毒蛋白表达（HBsAg、HBcAg）及病毒复制水平（HBV DNA、HBV mRNA）;同样在成功构建稳定敲低CREB1（shCREB1）的HepAD38细胞中,同正常表达HBV的肝癌细胞系Hep－AD38进行对照,检测经顺铂处理后的HBV复制水平（HBV DNA、HBV mRNA）及蛋白表达水平（HBsAg、HBcAg）。结果：稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38中,Western blot检测显示,与PBS对照组相比,Cisplatin处理组中CREB1相对表达量为1.355±0.049（P=0.010）;HBsAg蛋白相对表达量为1.679±0.060（P=0.003）;HBcAg蛋白相对表达量为1.488±0.047（P=0.005）。qRT-PCR结果显示经顺铂处理后,HBV DNA绝对表达量为249.600±54.400（P=0.006）;HBV mRNA相对表达量为3.084±0.256（P=0.000）;以上结果表明在HepAD38细胞中乙肝病毒蛋白表达水平以及病毒复制水平较PBS对照组明显上调,均具有统计学差异;与此同时,选择转入shCREB1质粒的HepAD38细胞,即shCREB1细胞,以及转入对照质粒且能正常表达CREB1的Hep－AD38细胞,即shControl细胞,2种细胞组内均设置PBS对照组和Cisplatin处理组,分别检测乙肝病毒蛋白表达以及病毒复制水平。qRT-PCR结果显示,HBV DNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为518.300±3.458;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为265.300±3.125（P=0.000）;HBV mRNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为2.713±0.318;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为1.263±0.056（P=0.000）。Western blot分析显示shControl细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.254±0.001、2.238±0.041;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.121±0.036（P=0.021）、1.681±0.015（P=0.000）。结论：顺铂可以通过CREB1促进乙肝病毒复制水平以及蛋白表达水平上调。     

短发夹状RNA抑制survivin基因在肝癌细胞中的表达

目的 构建抗凋亡因子survivin的短发夹状RNA(shRNA)，观察其在肝癌细胞株HepG2、SMMC—7721中对survivin基因表达的抑制作用。方法 设计，合成两对survivin编码基因的反向重复序列，中间分别间隔4和8个nt，分别定向克隆至载体pTZU6 1的U6转录启动子下，构建pshRNA—survivin1和pshRNA—survivin2重组质粒，与表达survivin基因的质粒pEGFP—Cl—survivin共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC—7721，荧光显微镜下观察融合蛋白中GFP的表达以分析pshRNA—survivin对survivin基因表达的抑制作用。结果 酶切分析和测序证实pshRNA—survivin1和pshRNA—survivin2构建成功；两组shRNA对survivin的表达均有明显的抑制作用，抑制率达80％以上；两重组质粒在HepG2和SMMC—7721两种细胞中抑制目的基因的作用无明显差异；反向重复序列中间隔4或8个nt构建的shRNA，对抑制目的基因的表达无显著差异。结论 构建的pshRNA—survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2、SMMC—7721中的表达。     

融合蛋白胸腺素α-干扰素与干扰素α对2.2.15细胞抗原表达的影响

临床上许多学者把α干扰素（IFN-α）和胸腺素α（TA1）联合起来治疗慢性乙型肝炎,结果发现联用效果明显优于单用IFN-α或TA1[1].     

丙型肝炎病毒5′非翻译区 DNA 序列在 HepG2细胞中的启动子活性

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因组5′非翻译区(5′UTR)DNA 序列在 HepG2细胞中 的启动子活性，以了解 HCV 的复制调控机制。方法 分别构建 HCV 基因组5′UTR DNA 正反向序列驱动 虫荧光素酶基因表达的质粒5′UTR-Luc(+)/(-)和5′UTR DNA 序列驱动绿色荧光蛋白基因表达的质粒5′ UTR-EGFP(+)/(-)，分别转染 HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，逆转录 聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因 m R N A 水平，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达水平，并与相应 对照作比较，来证实 HCV 基因组5′UTR DNA 序列的启动子活性。结果 5′UTR-Luc(+)有明显的虫 荧光素酶表达，但比 pGL3 control 表达水平低(Luc/R为0．690±0．086，Luc/RL 为4．210±0．340)，而5 ′UTR-Luc(-)和 pGL3 enhancer 无明显虫荧光素酶表达(Luc/RL 分别为0．095±0．008和0．044±0． 005)；逆转录聚合酶链反应结果与之相符，5′UTR-Luc(+)检测到虫荧光素酶基因 mRNA，而5′UTR- Luc(-)则未检测到。5′UTR-EGFP(+)观察到较强绿色荧光，而5′UTR-EGFP(-)无荧光表达。 结论 HCV 基因组5′U TR DNA 序列具有明显的启动子活性，能启动下游基因的表达，在 HCV 基因组复 制过程中有重要作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路.方法 将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达;用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR (MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达.结果 在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P＜0.05);甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰;甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P＜0.05).结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生.     

宫腔镜联合子宫动脉栓塞术在剖宫产切口瘢痕妊娠中应用的优势及可行性

目的:研究分析对于剖宫产(术后瘢痕妊娠)的患者采用宫腔镜联合子宫动脉栓塞术来治疗剖宫产切口瘢痕妊娠的优势及可行性。方法:选取行剖宫产(术后瘢痕妊娠)的30例患者,患者均采用宫腔镜联合子宫动脉栓塞术进行剖宫(入院后行子宫动脉栓塞术,术后1~2 d行宫腔镜下清宫)。观察患者子宫剖宫产后疤痕妊娠状况。结果:所有的患者在治疗后的2天血β-HCG下降到(193.76±116.99)U/L,当治疗后的24 d患者的血β-HCG下降到(111.62±36.26)U/L,及患者的病灶直径由(3.64±1.02)cm缩小到(3.10±0.89)cm,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:宫腔镜联合子宫动脉栓塞术可以有效治疗剖宫产切口瘢痕妊娠,在临床上值得更深入的研究分析。     

几种肿瘤特异性启动子在人肝癌细胞系中的活性比较

目的 克隆甲胎蛋白(AFP)、survivin(SUR)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子,检测并评价其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法 采用PCR法扩增获得AFP、SUR、hTERT基因的启动子片段,将之克隆到表达虫荧光素酶基因的报告质粒上,检测AFP、SUR、hTERT基因启动子在肝癌细胞系和正常组织中的转录活性,评价其转录活性水平和肿瘤特异性.结果 成功克隆了AFP、SUR、hTERT启动子,证实AFP、SUR、hTERT启动子在肝癌细胞中具有肿瘤特异性转录活性,SUR启动子活性最高,其活性水平为AFP启动子的52～98倍;hTERT启动子次之,其活性水平为AFP启动子的14～30倍;AFP启动子活性最低.结论 hTERT和SUR启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性和显著的肿瘤特异性,可望开发成为新型的肝癌靶向性基因治疗工具.     

重组腺病毒IkBαM在裸鼠体内对人肝癌细胞HepG2的凋亡作用

细胞核因子kB(NF—kB)是一种广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子，其活性受到一个强抑制物核因子kB抑制物(IkB)的抑制，在外界刺激剂的作用下，IkB发生磷酸化并降解，核因子kB转入核内与靶基因kB的基序结合，增强其表达。Kucharczak等证实核因子kB在肿瘤增殖和抗凋亡中扮演重要角色。