乙型肝炎病毒感染患者肝移植术后再感染及其机制

肝移植已成为终末期肝脏疾病的一个重要治疗手段。但是，乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝病患者肝移植术后，乙型肝炎的复发率达70％～80％，严重地影响了肝移植术的远期效果，成为亟待解决的一个问题。作者在对肝移植患者HBV再感染随访观察的基础上，采集外周血单个核淋巴细胞(PBMC)，进行HBV DNA定量检测和HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的定性检测，对肝移植术后患者HBV再感染的状况及其机制进行了探讨。     

乙型、丙型肝炎DNA疫苗单次联合接种后小鼠的免疫应答

目的：观察由编码ＨＢｓＡｇ与ＨＣＶ－ＣＥ２抗原的两种重组真核细胞表达质粒制备的ＤＮＡ疫苗联合接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后,其施生行异性免疫应答的规律和相互影响。方法：应用上述２种ＤＮＡ疫苗单次联合免疫小鼠,动态观察血中特生抗体水平;并完成稳定转染,表达相应抗原的ＳＰ２／０骨髓瘤细胞的建株,采用ＣＴＬ杀伤活性体内诱生实验的方法建立观察ＤＮＡ疫苗免疫保护与治疗泊动物模型。结果：两种ＤＮＡ疫苗单次联合免疫小鼠     

hnRNPB_1基因的RNA干扰抑制肺癌细胞A549增殖研究

目的 探讨特异性小分子干扰(small interference,siRNA)抑制肺癌A549细胞核内不均一核糖蛋白B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPB1)基因的表达后,对A549细胞增殖的影响. 方法构建hnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549,观察重组载体分别在第1、4及6周对A549细胞hnRNPB1基因的干扰效果以及对肺癌细胞周期及凋亡的影响.结果 特异性siRNA真核表达可显著抑制肺癌细胞hnRNPB1基因的表达,使hnRNPB1 mRNA的表达减少46%～73%,蛋白表达减少77.69%～83.04%,作用时间至少可维持克隆形成后4周,同时,hnRNPB1基因表达下调抑制了A549细胞在体外的增殖,促进了肺癌细胞的凋亡.结论 特异性siRNA能特异、高效地抑制肺癌细胞株A549细胞hnRNPB1基因的表达,RNAi可能为肺癌的基因治疗提供新策略.     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

复制型HBV重组腺病毒的制备

目的 通过细茼体内同源重组方法,构建含1.3拷贝HBV DNA片段(HBV4.1)的HBV复制型重组腺病毒.方法 从质粒pTh-HBV4.1上获取HBV4.1片段,插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建含HBV4.1的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/HBV4.1.然后在大肠杆菌BJ5183内与pAdEasy-1进行同源重组,形成重组腺病毒质粒pAd-GFP/HBV4.1,经脂质体2000转染HEK293细胞进行包装和扩增,获得腺病毒Ad-CFP/HBV4.1.通过荧光显微镜下观察GFP绿色荧光蛋白的表达,检测腺病毒滴度和感染效率;采用PCR法检测腺病毒DNA上有无HBV基因组存在.结果 经酶切鉴定确认含HBV穿梭质粒pAdTrack-CMV/HBV4.1和重组腺病毒基因组质粒pad-GFP/HBV4.1构建成功;GFP荧光检测提示重组腺病毒Ad-GFP/HBV4.1已成功包装;PCR扩增表明重组腺病毒内携带有HBV DNA片段.在HEK293细胞中获得的病毒滴度可达(4.2～4.8)×107 efu/ml;当MOI为100时,感染HEK293细胞的效率>90%.结论 成功构建了携带1.3拷贝HBV基因组的重组腺病毒Ad-GFP/HBV4.1,为进一步建立高水平HBV复制型细胞和动物模型以用于HBV生物学特性的研究英定了基础.     

体外定向诱导脐血间充质干细胞向类肝细胞分化的研究

目的 探讨诱导人脐血间充质干细胞（UBCMSCs）向类肝细胞定向分化的可能性。方法 采用密度梯度离心法与直接贴壁法相结合，从人脐血中分离UBCMSCs；通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44，确定UCBMSCs的比例。在UCBMSCs培养体系中，加入人肝细胞株L-02细胞培养上清液或诱导因子（联用HGF和FGF-4）共培养，检测诱导后第7天、14天细胞内细胞角蛋白18（CK18）、白蛋白及糖原的表达。结果 从脐血中分离获得均一贴壁的UBCMSCs；在UBCMSCs培养体系中，无论是添加L-02细胞培养上清液，还是采用诱导因子HGF和FGF-4，均可诱导UCBMSCs细胞内表达中晚期成熟肝细胞表面标志物CK8＆18、白蛋白及糖原。结论 密度梯度离心法和直接贴壁法相结合能够有效分离UCBMSCs；L-02人肝细胞培养上清液或诱导因子HGF、FGF-4均具有诱导UCBMSCs向类肝细胞定向分化的作用。     

综合性医院抗菌药物应用管理成效

目的 通过综合干预促进抗菌药物的临床合理应用。方法 成立医院抗菌药物使用管理专家咨询组，制定各专业抗菌药物使用规范，进行抗菌药物应用培训和检查，统计病原菌分布及耐药性变迁；随后分别抽取2000、2002、2004年出院病历的10％，分析抗菌药物使用和病原菌送检率。结果 采用上述措施后，预防和治疗性使用指征的构成比明显提高（P〈0．01）；除内科外各科抗菌药物联用比例降低（P〈0．01）；病原菌送检率明显提高（P〈0．05）。结论 通过临床医师、药剂师、检验和感染管理人员等的共同参与，可以达到控制和合理使用抗菌药物的目的。     

利用高压注射体内转染法实现HBsAg在小鼠肝脏中的高效表达

目的：观察能否应用高压注射体内转染法实现外源DNA在肝脏中高效表达,为嗜肝病毒分子生物学研究奠定方法学基础.方法：将大容量乙肝病毒表面抗原表达质粒pVAX1/S DNA溶液,通过尾静脉快速注射入小鼠体内,用免疫组化检测小鼠心、肺、肝、脾、肾组织中HBsAg的表达情况.结果：经小鼠尾静脉高压注射pVAX1/S质粒DNA后,HBsAg主要在肝脏表达;且高压注射组明显强于缓慢注射组;高压注射5μg pVAX1/S质粒DNA后8小时,在肝脏观察到较强的HBsAg表达.结论：通过尾静脉高压注射,能实现HBsAg主要在肝脏高效表达.     

肝癌细胞p15基因CpG岛甲基化研究

目的通过检测肝癌细胞株HepG2的抑癌基因p15基因启动子区CpG岛的甲基化状态,探讨其与肿瘤发生的可能相关性。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)技术,对人肝癌细胞株HepG2的p15基因启动子区域CpG岛的甲基化状态进行检测,以人淋巴瘤细胞株Raji为阳性对照,以正常人外周血单核细胞(PBMC)和肝细胞为阴性对照。结果肝癌细胞HepG2中p15基因启动子区域CpG岛甲基化和非甲基化检测均呈阳性,正常人外周血单核细胞和肝细胞甲基化检测阴性。结论肝癌细胞株HepG2抑癌基因p15基因CpG岛存在高度甲基化,可能与肝癌的发生相关。     

肝细胞核因子3结合位点的突变及对抑制乙型肝炎病毒复制的影响

目的 研究肝细胞核因子(HNF)3结合位点HNF3β对HBV转录和复制调节作用的机制.方法 通过分别位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1p和sp区上的HNF3结合位点,构建HBV基因组2个或3个位点的复合突变,获得4个复合突变型重组质粒;分别转染非肝源性细胞小鼠成纤维细胞株(NIH3T3),Northern印迹法检测3.5 kb、2.4 kb/2.1 kb、0.7 kb HBV RNA的转录水平,Southern印迹法检测HBV DNA复制中间体水平,观察上述突变是否会影响HNF3β对HBV转录和复制的抑制作用.结果 在被转染的非肝源性细胞3T3中,HNF3β仍能降低4个复合突变型HBV重组质粒3.5 kb HBV RNA的转录水平,抑制HBV DNA的复制;与未共转染HNF3β相比,转录水平下降50%～75%、复制水平下降80%～96%.结论 在位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1p和Sp区上的3个HNF3结合位点中,即使其中2个或3个结合位点同时联合突变,HNF3β仍能抑制HBV的转录和复制.Pp、PS1p和Sp区HNF3结合位点的突变不能阻断HNF3β对HBV复制的抑制作用.