抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)M蛋白N端1~43氨基酸(aa)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb。用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株。Westernblot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性,并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAbIg亚类。为分析mAb识别位点,进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达,以Westernblot初步定位mAb识别位点。结果:获得1株可分泌特异性抗SARS-CoVM蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株(3H9),Ig亚类鉴定为IgG2a,轻链为κ型。Westernblot显示其mAb可特异识别SARS-CoVM蛋白N端1~43aa,间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应,其识别位点位于M蛋白N端16~28aa。结论:成功获得1株抗SARS-CoVM蛋白N端1~43aamAb杂交瘤细胞,并初步定位其识别位点。     

HIV-1感染相关细胞因子IFN-γ通过Rta基因启动子激活人类疱疹病毒8型

目的　研究HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ对人类疱疹病毒 8型 (HHV 8)Rta基因启动子活性影响 ;评价Rta基因启动子在多种细胞中的启动活性。方法　将已构建的HHV 8Rta启动子 虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV 1Tat基因重组表达质粒转染多种细胞 ,转染后 2 4h加入IFN γ和 或重组HIV 1gp12 0刺激 ,刺激后 2 4h收集细胞 ,进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯类化合物TPA刺激为阳性对照 ,进行最佳刺激时间点的选择和不同转染方法转染效率的比较。结果　①HHV 8Rta启动子启动活性在TPA刺激后的 2 4h达到最高峰 ;②HHV 8Rta启动子启动活性的发挥不依赖于HHV 8和 或EBV基因组的存在 ,且在血管内皮细胞 (HUVECs)中启动活性最佳 ;③IFN γ可以诱导Rta启动子活性 ;但HIV 1Tat和gp12 0蛋白与IFN γ协同上调Rta启动子活性的能力较弱。结论　HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ至少部分通过Rta基因启动子激活HHV 8的复制     

CDCP1基因重组慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响

目的: 构建含CUB结构域包含蛋白1（CUB domain containing protein 1,CDCP1）基因的重组慢病毒表达载体,研究CDCP1蛋白对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响。方法: 以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）cDNA为模板,采用PCR法扩增出CDCP1基因,将其克隆至pHAGE CMV MCS IzsGreen载体中,构建重组慢病毒表达载体pHAGE-CDCP1。将重组质粒pHAGE-CDCP1以及对照质粒pHAGE分别与包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.G共转染入人胚肾上皮细胞（293 T细胞）,48 h后收集病毒悬液,并采用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒CDCP1感染人宫颈癌HeLa细胞,通过免疫印迹法检测CDCP1蛋白的表达,采用CCK-8实验检测过表达 CDCP1对 HeLa 细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell细胞迁移实验观察过表达CDCP1对HeLa细胞迁移能力的影响。结果： 质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE-CDCP1构建成功。重组pHAGE-CDCP1慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞后细胞状态良好,CDCP1蛋白表达水平明显增加。高表达CDCP1可以显著提高HeLa 细胞的增殖和迁移能力。结论： 过表达CDCP1能够促进宫颈癌 HeLa 细胞的增殖和迁移。     

5-FC/CD∷UPRT联合基因对大鼠脑胶质瘤的治疗作用

目的探讨5-氟胞嘧啶(5-FC)/CD∷UPRT联合基因系统对大鼠脑胶质瘤的治疗作用。方法以逆转录病毒介导构建C6-CD∷UPRT细胞系,应用立体定向技术移植C6-CD∷UPRT细胞至SD大鼠尾状核,设立C6-pLXSN和C6细胞为对照组,建立脑胶质瘤荷瘤鼠模型,应用5-FC腹腔注射治疗,观察肿瘤大小、大鼠存活期、电镜观察细胞形态和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡指标的变化。结果5-FC/CD∷UPRT治疗组(A组)与各对照组相比,A组肿瘤直径平均为(4.2±0.7)mm,远小于对照组的(8.3±1.3)mm,(P<0.01);对照组平均存活期(32±3)d,A组为(85±2)d(P<0.01);A组电镜显示核染色质分裂明显,并见典型的凋亡小体;A组肿瘤细胞中凋亡细胞所占百分率为19.36%。结论5-FC/CD∷UPRT联合基因对大鼠脑胶质瘤有显著的治疗效果。     

住院和非住院精神分裂症患者社会功能缺陷的调查分析

目的:探讨慢性精神分裂症患者的社会功能缺陷压其相关因素.方法:用精神病人社会功能评定量表对100例患者横向和纵向进行评定.结果显示:精神分裂症患者无论是长期住院还是非住院患者相当比例的病人都有不同程度的社会功能缺陷,同时与患者的精神症状、住院环境、家庭有关.结论:积极治疗患者的精神症状,缩短住院时间积极调动社会和家庭的关心,对减轻患者社会功能缺陷,提高生活质量具有重要意义.     

超声介导自制白蛋白微泡和声诺维对体外报告基因转染效率的比较研究

目的:探讨超声介导微泡破裂法促进外源基因的安全转移的方法,为临床上肿瘤等疾病的基因治疗研究提供新的思路。方法:以绿色荧光蛋白基因为标记基因,以人大肠癌细胞株SW480为靶细胞,分别以自制白蛋白微泡和声诺维(SonoVue)微泡作为载体,通过超声介导微泡破裂法促进绿色荧光蛋白GFP基因在人大肠癌细胞株的定向转染,以激光共聚焦显微镜来定性和半定量观察GFP在靶细胞的表达情况,以椎虫蓝染色法检测超声作用于细胞的安全性。结果:当超声的强度为0.75W/cm2,作用时间为40s时,对细胞比较安全;自制白蛋白微泡和声诺维微泡的浓度为10%时,分别达到最佳的基因转染效率,两者无显著性差异,但后者的相对表达强度较高。结论:超声介导微泡破裂法促进外源基因的转移是一种比较安全而有效的基因转染方法。     

HIV-1感染相关细胞因子激活BC-3细胞中潜伏感染的人类疱疹病毒8型的复制研究

目的:研究证实HIV-1感染相关细胞因子能够诱导原发性渗出性淋巴瘤(PEL)的另一细胞系BC-3中潜伏的人类疱疹病毒8型(HHV-8)发生可溶性周期复制。方法:将TNF-α和HIV-1感染CD4~+ T淋巴细胞常释放的细胞因子IFN-γ、HGF/SF、OSM,连续加入到BC-3细胞中作持续刺激,分别于刺激后的第3天和第7天收集BC-3细胞。采用免疫组化染色法(IHC)检测HHV-8免疫原性蛋白ORF59表达;电子显微镜观察病毒的形成;Northernblot和 定量PCR检查次要衣壳蛋白ORF26 mRNA转录。结果:IFN-γ、HGF/SF、OSM和TNF-α均能不同程度上调ORF26 mRNA表达。其中,IFN-γ刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达上升了6.1倍;ORF59蛋白表达上升到20％,与此同时,BC-3细胞中可观察到成熟的病毒粒子。另外,TNF-α刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达也上升了2.5。结论:TNF-α和HIV-1感染释放细胞因子能够诱导PEL另一细胞系BC-3中潜伏的HHV-8发生可溶性周期复制。     

反义K-ras基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨反义K-ras癌基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡及Fas/FasL、Bcl-2、Bax表达的影响.方法 将重组逆转录病毒载体pLXSN转染包装细胞PT-67,获得重组逆转录病毒.在细胞和动物水平将该重组逆转录病毒分别感染PC-3和BxPC-3胰腺癌细胞,经G418筛选获得稳定细胞系,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增殖、凋亡及其相关基因表达情况.结果 成功制备含反义K-ras基因的重组逆转录病毒.感染含反义K-ras基因重组病毒后,胰腺癌PC-3细胞和移植瘤(有K-ras基因第12密码子点突变GGT→GTT)增殖受到抑制,G<,0/1>期细胞增加而S期细胞明显减少,细胞凋亡增加.免疫组化显示含反义K-ras癌基因逆转录病毒感染后PC-3细胞Bax/Bcl-2比值升高,Fas表达上调.结论 反义K-ras基因可使胰腺癌细胞及移植瘤增殖受到抑制,并可通过上调Bax/Bcl一2比值和(或)促进Fas表达诱导细胞凋亡.     

真菌源性CD::UPRT联合基因治疗脑胶质瘤的实验研究

目的研究5-FC/CD：：UPRT联合基因治疗策略对胶质瘤细胞C6的杀伤效应。方法扩增yCD：：UPRT融合基因并构建含yCD：：UPRT基因的重组表达载体；载体转染包装细胞PT67,所获重组病毒转染胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆；用MTT法检测不同浓度5-FC对CD：：UPRT转基因细胞的杀伤效应。结果PCR法扩增出全长CD：：UPRT基因,经测序证实序列正确,重组逆转录病毒表达载体pLXSN-yCD：：UPRT经双酶切获目的条带,载体转染包装细胞获重组逆转录病毒(滴度达3．5×10~6CFU/ml)并转染C6,经筛选获得转基因阳性克隆C6-yCD：：UPRT细胞株,检测显示该细胞株有效表达目的基因。当5-FC终浓度≥10μmol/L时,实验组与对照组的细胞增殖力出现显著差异(P＜0．01),5-FC作用96h后电镜观察到凋亡小体。结论5-FC/yCD：：UPRT联合基因治疗策略对胶质瘤细胞C6有明显的杀伤作用。     

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备人类疱疹病毒8型（HHV-8）包膜糖蛋白K8．1的单克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：用异丙基硫代一β—D一半乳糖苷（IPTG）诱导含重组质粒pGEX-6p-1 ＋K8．1的大肠杆菌BL21表达符胱甘肽-S-转移酶GST／K8．1融合蛋白，将以包涵体形式存在的融合蛋白进行变性、复性、复性后的Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化。以纯化的GST／K8．1融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠．常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌K8．1单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化染色（IHC）和Western blot法鉴定单抗的特异性。结果：建立了一株稳定分泌抗K8．1单抗的杂交瘤细胞株．命名为3G10：IHC和Westerfl blot法显示．3G10株单抗能特异地识别HHV-8K8．1蛋白。结论：成功制备出抗HHV-8包膜糖蛋白K8．1的单克隆抗体。