circRNA 404524在PM_(2.5)致BEAS-2B细胞炎症过程中的功能及机制研究

目的研究circRNA 404524在PM_(2.5)致永生化人支气管上皮样细胞(BEAS-2B)炎症过程中表达改变,探索circRNA在PM_(2.5)致气道炎症过程中的功能及机制。方法 BEAS-2B细胞分为6组:NT组(DMSO),PM_(2.5)组(75μg/ml PM_(2.5)),NC组(转染空载体质粒+DMSO),NC+PM_(2.5)组(转染空载体质粒+75μg/ml PM_(2.5)),OE组(转染circRNA 404524+DMSO),OE+PM_(2.5)组(转染circRNA 404524+75μg/ml PM_(2.5))。使用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测circRNA 404524在75μg/ml PM_(2.5)染毒BEAS-2B细胞中的表达水平,同时通过转染circRNA 404524的过表达载体联合75μg/ml PM_(2.5)染毒后检测circRNA404524、IL-6及IL-8的表达水平。检测circRNA 404524在BEAS-2B细胞胞浆/胞核的表达水平,分析其表达位置。通过KEGG生物信息学软件分析circRNA 404524可能参与调控的基因通路,而后检测NF-κB炎症通路关键基因的表达水平。结果与NT组相比,circRNA 404524在PM_(2.5)组表达下调,相对变化倍数为2.63,差异有统计学意义(P0.01)。转染circRNA 404524过表达载体后,通过检测发现,相比于NC组,OE组中circRNA 404524上调154.74倍,差异有统计学意义(P0.01)。检测炎症因子表达水平发现,与NC组相比,OE组中IL-6及IL-8表达均下调,差异均具有统计学意义(P0.05),NC+PM_(2.5)组中IL-6和IL-8表达均上调,差异均具有统计学意义(P0.01)。胞浆胞核定位结果显示circRNA 404524主要在胞核表达,检测NF-κB炎症通路关键基因的表达水平发现,相比于NC组,OE组中IKK-alpha、IKB-alpha及NFKB1表达均下调,NC+PM_(2.5)组中表达均上调,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论 circRNA 404524在PM_(2.5)染毒的BEAS-2B细胞中低表达,将其过表达后,PM_(2.5)引起的炎症水平降低,提示其在PM_(2.5)染毒致BEAS-2B细胞炎症过程中发挥抑炎基因的作用,并可能通过对NF-κB炎症通路的调控发挥功能。     

苯并芘诱导细胞转化过程中PP2A B56ε表达与DNA损伤修复功能的研究

目的：探讨蛋白磷酸酶2A-B56ε亚基（PP2A B56ε,由PPP2R5E基因编码）的表达在苯并芘诱导细胞转化过程中对DNA损伤修复功能的影响。方法实时荧光定量-PCR（QRT-PCR）检测BEAS-2B细胞（人正常肺上皮细胞）、和BEAS-2BT细胞（苯并芘诱导恶变的人肺上皮细胞）中PPP2R5E的mRNA转录水平;免疫印迹法（Western Blot）检测细胞中 B56ε编码蛋白的水平;中性单细胞凝胶电泳实验（彗星实验,SCGE）检测喜树碱（ camptothecin,CPT）处理的细胞DNA断裂损伤及修复情况;免疫印迹法检测 CPT 处理诱导γH2AX（磷酸化组蛋白 H2AX）水平。结果与 BEAS-2B 细胞相比较,BEAS-2BT 细胞中PPP2R5E其mRNA水平及B56ε蛋白水平均显著高表达（P〈0.05）。与BEAS-2B细胞相比,经CPT处理恢复后,BEAS-2BT细胞尾距显著降低（P〈0.05）。表明BEAS-2BT细胞中H2AX的磷酸化水平明显降低。结论在苯并芘诱导细胞转化过程中PP2A B56ε通过介导γH2AX去磷酸化影响DNA损伤修复功能。     

苯并[a]芘致肺癌中circRNA 001988及其靶基因的表达改变

目的研究苯并[a]芘恶性转化的肺癌细胞16HBE-T中circRNA 001988的表达及其下游靶基因的表达改变,并探索该circRNA在化学致癌过程中可能发挥的作用。方法采用q RT-PCR检测circRNA 001988在16HBE-T中的表达,进一步在人肺癌细胞株A549、H460和H446中检测其表达,同时在20例肺癌组织样品中检测了circRNA 001988的表达水平;利用生物信息学分析软件mi RSystem和RegRNA,预测得到circRNA 001988靶向的microRNA以及与其相互作用的mRNA;采用q RT-PCR在16HBE-T和H460中检测microRNA及mRNA的表达。结果与16HBE相比,circRNA 001988在16HBE-T中的表达下调了(6.54±0.75)倍,差异有统计学意义(P0.01),而在A549和H460细胞中表达分别下调(2.06±0.38)倍、(3.02±0.51)倍,差异均有统计学意义(P0.05)。与癌旁组织相比,circRNA 001988在肺癌组织中的表达平均下调了(2.11±0.71)倍,差异有统计学意义(P0.05)。结合生物信息学预测分析和qRT-PCR检测发现,相对于16HBE,circRNA 001988靶向的hsa-mi R-382-5p和hsa-miR-583在16HBE-T和H460细胞中的表达均上调,而hsa-miR-382-5p和hsa-miR-583共同作用的mRNA(CCDC6)的表达水平分别降低(26.20±3.92)倍、(12.61±1.48)倍。结论 circRNA 001988在苯并[a]芘恶性转化的16HBE-T细胞中的表达水平明显降低,它在苯并[a]芘致肺癌过程中可能发挥抑癌因子的作用,并可能通过内源性竞争的机制影响其下游的microRNA和mRNA的表达。     

circRNA002144在PM_(2.5)诱导人正常支气管上皮细胞炎性反应中的机制研究

目的研究circRNA002144在PM_(2.5)暴露人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的表达及其下游靶基因的差异表达情况,并探讨circRNA002144在PM_(2.5)诱导BEAS-2B细胞发生炎性反应中可能的调控机制。方法分别以0、30、60、90、120、150μg/ml的PM_(2.5)暴露BEAS-2B细胞48 h,收集细胞上清液用酶联免疫(ELISA)实验检测白细胞介素-6(IL-6)的分泌量;收集细胞,以Trizol试剂裂解细胞后提取总RNA,以实时定量PCR(q RT-PCR)检测不同浓度PM_(2.5)染毒BEAS-2B细胞中circRNA002144表达水平的变化;然后利用RegRNA和Target Scan预测与circRNA002144相互作用的miRNAs以及靶向的下游mRNA,选择炎症相关的mRNA进一步检测。结果与对照组相比,不同浓度的PM_(2.5)染毒组BEAS-2B细胞炎性细胞因子IL-6的表达均升高,且有剂量依赖关系;circRNA002144的表达水平均升高,且随着PM_(2.5)染毒浓度的增加呈高表达,在120μg/ml染毒组,相对表达量增高4.79倍,差异均有统计学意义(P0.01);结合生物信息学预测分析和q RT-PCR检测发现,相比于对照组,与circRNA002144相互作用的hsa-mi R-608和hsa-mi R-92a-2-5p在PM_(2.5)染毒组细胞呈现低表达的趋势,这两个miRNAs共同靶向的STAT3则呈现高表达,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 circRNA002144在PM_(2.5)诱导BEAS-2B细胞发生炎性反应中可能发挥促炎的作用,可能通过下调hsa-mi R-608和hsa-mi R-92a-2-5p促进IL-6分泌,进而激活STAT3炎症通路。