利用SUMO系统高效可溶性表达重组人TNF-a

目的:从人淋巴细胞中克隆人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因,构建原核表达载体,通过表达、纯化,获得具有生物学活性的hTNF-α,为深入研究和利用hTNF-α奠定基础.方法:利用RT-PCR方法从人淋巴细胞中克隆hTNF-α基因,并分别插入到pGEX-6P-1的GST标签和pHisSUMOexpression 的SUMO(small ubiquitin-like modifier)标签下游构建成重组表达载体pGEX-6P-1-hTNF,和pHisSUMO-hTNF-a.将两种载体分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),比较两种载体hTNF-α表达量及可溶性的差异.选择表达效果较好的重组载体对hTNF-α进行诱导表达,经纯化并切去融合标签后获得成熟hTNF-α蛋白.以1929细胞为靶细胞,利用MTT比色法检测其细胞毒活性.结果:克隆得到hTNF-α编码基因,利用pGEX-6P-1载体表达的GST-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的27%,主要以包涵体形式表达,经低温诱导后可溶性提高了约50%,但表达量有所降低.而利用pHisSUMO-expression表达的SUMO-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的30%以上,且主要以可溶形式存在.本实验中选择SUMO系统表达hTNF-α,纯化后成熟蛋白纯化产物纯度达98%以上.活性测定结果表明,获得的成熟hTNF-α对1929的细胞毒活性为5.01×108U/mg.结论:与GST标签相比,SUMO利于hTNF-α的可溶性表达.经过纯化并切去融合标签后获得了纯度较高的具有生物学活性的hTNF-α蛋白.     

FGF-21通过上调肝脏LDL受体的表达降低血浆中LDL水平

目的成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)可降低实验动物血浆中的低密度脂蛋白(LDL)的浓度,但其作用机制尚不清楚,本实验试图通过研究FGF-21对LDLR的调节作用揭示FGF-21调节血浆LDL浓度的机制。方法向谷氨酸钠(MSG)肥胖大鼠连续注射FGF-21蛋白40d后,检测其血浆中LDL的变化,并用荧光定量PCR的方法结合免疫荧光检测FGF-21对肝脏组织中LDLR mRNA及蛋白的影响。结果 MSG肥胖鼠经FGF-21处理,血浆内的LDL降低18%,其肝脏组织中LDLR mRNA含量提高9倍;HepG2细胞内的LDLR mRNA表达量随FGF-21处理时间增加而提高,且呈剂量依赖性;流式细胞仪检测显示,经FGF-21处理后HepG2细胞表面LDLR蛋白数量增加。结论 FGF-21通过增加肝细胞的LDLR表达量从而降低血浆中LDL浓度。     

成纤维细胞生长因子21对胰岛素抵抗所致高血压的治疗作用

本文研究考察成纤维细胞生长因子21(FGF21)对果糖诱导的胰岛素抵抗高血压模型的治疗作用及其机制。10%果糖诱导SD大鼠4周建立胰岛素抵抗高血压模型,成模后随机分为4组:模型对照组及FGF210.25、0.1和0.05μmol·kg-1·d-1剂量组,5只相同周龄的正常SD大鼠作为正常对照组。每天注射1次,治疗4周,给药期间每周监测大鼠体重,采用尾套法检测收缩压变化;口服葡萄糖耐量试验(OGTT)及胰岛素稳态评价模型检测胰岛素抵抗情况;给药结束时留取血清样本分别测定血清胰岛素、血脂、血糖水平。结果显示,治疗4周后,不同剂量FGF21治疗组大鼠收缩压均下降至正常水平[(122.2±3.5)mmHg,P<0.01],而注射生理盐水的模型对照组大鼠的收缩压在治疗期间一直维持在较高水平[(142.5±4.5)mmHg]。24 h观察各组大鼠血压发现,FGF21治疗组大鼠24 h血压基本维持在(130±4.5)mmHg,各时间段血压均显著低于模型对照组[(130±4.5)vs(143±5.5)mmHg,P<0.01]。FGF21治疗组大鼠血脂改善明显,总胆固醇与甘油三酯含量均显著下降至正常水平。FGF21各治疗组大鼠血清NO含量均显著高于模型对照组[(7.32±0.11),(7.24±0.13),(6.94±0.08)vs(6.56±0.19)μmol·L-1,P<0.01],且其改善程度呈现明显的剂量依赖性,表明FGF21可明显升高果糖诱导高血压模型大鼠血清NO含量,改善内皮释放NO功能。OGTT及HOMA-IR结果显示,经FGF21治疗4周后胰岛素抵抗亦明显得到改善,且呈现剂量依赖性。因此本研究揭示了FGF21通过改善胰岛素抵抗,显著降低SD大鼠由于胰岛素抵抗所引起的高血压。这一发现为临床应用FGF21治疗原发性高血压奠定了理论基础。     

小鼠白细胞介素17A的克隆、表达及活性鉴定

目的:克隆小鼠白细胞介素17A(mIL-17A)基因,构建mIL-17A原核表达质粒在E.coil Rosetta(DE3)PlysS表达,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-17A序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的编码序列并构建到pMD18-T载体中,再亚克隆至原核表达载体pHisSUMO Express中,经DNA测序鉴定后转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。纯化后的蛋白处理3T3-L1前体脂肪细胞,real time PCR鉴定白细胞介素6(IL-6)的表达变化。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致。成功构建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表达质粒以包涵体形式表达了重组mIL-17A蛋白,且Western blot证实为目的蛋白。所得蛋白上调3T3-L1细胞表达IL-6。结论:获得具有生物活性的mIL-17A蛋白,为进一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基础。