达托霉素生产菌(ATCC31568)的紫外诱变和抗生素抗性筛选

目的 建立一种提高达托霉素生产水平的方法.方法 以玫瑰孢链霉菌(ATCC31568)为出发菌株,利用紫外诱变结合抗生素抗性筛选以提升达托霉素生产水平.结果 通过对致死率和正突变率的考察,确定紫外诱变时间为45s,利福平和庆大霉素的合适筛选浓度分别为1.4μg/mL、1.0μg/mL,得到的突变株经摇瓶发酵后,采用高效液相色谱仪(HPLC)对最终发酵液进行检测.筛选到的突变株Ge-27最高产量达到79.44 mg/L,比原始菌株提高了42.2％.结论 采用紫外诱变结合抗生素抗性筛选得到了达托霉素合成水平提高的菌株.     

大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体的构建及功能验证

目的构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达。方法从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合转移元件oriT、定点整合元件attp-int和安普霉素抗性基因Am的DNA片段替换其上的氯霉素抗性基因,该DNA片段通过PCR扩增得到,两端为待替换氯霉素抗性基因上下游55 bp的同源臂,替换后的载体通过酶切连入链霉菌组成型启动子ermEP1P2和绿色荧光蛋白（GFP）基因以验证其接合和整合功能。结果原载体pBeloBAC11的氯霉素抗性基因被成功替换,得到载体pBTIBAC1,利用该载体可在变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）TK24和1326中表达GFP,在pBTIBAC1上插入新的多克隆位点（MCS）后得到载体pBTIBAC11。结论 pBTIB AC11载体可通过接合转移携带外源基因片段进入链霉菌并整合至其基因组中,同时保留了原有BAC载体的功能元件,为大片段在链霉菌中的异源表达奠定了基础。