研讨型教学法在生物药物学教学中的实践与探索

生物药物学是一门知识更新快、专业性强、多学科融合的应用型学科,为提升教学效果,运用探讨型教学方法,本着以学生为主体的思想,对该门课程教学实践中涉及到的具体问题和实施方式进行的总结和探讨。     

基因工程酵母菌来源的D-氨基酸氧化酶分离纯化

目的以基因工程酵母表达的胞内D-氨基酸氧化酶(DAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化DAAO。方法采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经DEAE Sephadex A-50,DEAE-DE52,Q-sepharose等离子交换柱进行第一步分离,获得的含酶粗品,再经Sephacryl S-100分子筛进一步纯化获得电泳纯的DAAO。结果超声波破壁为最佳的破壁方法,得到的每毫升酶液所含的酶活力是其他破壁方法的两倍以上,最高达到12000U／mL。两步硫酸铵沉淀能粗分DAAO,50％硫酸铵沉淀酶回收率可达85％以上。用Q-sepharose、Sephacryl S-100分子筛柱层析两步纯化,酶活力回收率最高可达90％,SDS-PAGE显示单一蛋白条带。结论本实验方法能得到电泳纯的DAAO,总回收率约为40％。     

不同构建策略对D-氨基酸氧化酶表达的影响及发酵调节

目的 构建不含编码β-内酰胺酶编码基因的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)工程菌,对不同构建策略构建的重组菌进行发酵调节研究.方法 采用分子生物学手段,利用不同的策略、不同的毕赤酵母宿主菌,构建DAAO工程菌;利用微生物发酵和调节手段,对工程菌的发酵条件进行优化.结果 获得了表型不同的3株重组菌(Muts的PDK13和PDGA10,Mut 的PDG27),它们的最佳生长条件基本相似,诱导表达条件却不相同,在Basal salts培养基内,当生长时间为36 h,诱导培养基起始pH为6.0、甲醇浓度为0.5%时,最有利于DAAO表达.在菌体密度相同的条件下,Mut 表型(PDG27)甲醇代谢快,诱导24 h,DAAO活力达到最高;Muts型(PDK13和PDGA10)甲醇代谢慢,诱导36 h,DAAO活力达最高;通气量一定时,菌体密度增加,DAAO表达量增加,菌体增加到一定程度表达量反而下降,表明通气量应随菌体密度的增大而增加.结论 Muts型重组菌对通气量要求低且更有利于高密度发酵.     

抗病毒前体药物的研究进展

前体药物（简称前药）为一类在体外活性较活或无活性，在体内经过酶或非酶作用，释放出活性物质而发挥药理作用的化合物。与母体药物相比，前药具有提高生物利用度，增加水溶性，延长作用时间，减少不良反应，克服首过效应，定位达靶器官等特性。本文对抗病毒前体药物研究进展作介绍。     

载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)促进单核细胞源性巨噬细胞产生前列腺素E2 (PGE2)和前列腺素D2 (PGD2)

 目的 探讨人单核细胞THP-1源性巨噬细胞产生的Lipocalin型前列腺素D合酶(lipocalin type prostaglandin D synthase,L-PGDS)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和前列腺素D2 (PGD2)与载脂蛋白A-Ⅰ (apolipoprotein A-Ⅰ,apoA-Ⅰ)抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作用之间的关系。 方法 采用MTT法确定合适的给药浓度。用不同浓度(0、12.5、25、50、100和200 μg/mL) apoA-Ⅰ处理体外培养的THP-1细胞源性巨噬细胞24 h后,逆转录 聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测L PGDS mRNA表达的变化,酶联免疫测定法(ELISA)检测PGE2和PGD2 蛋白表达的变化。结果 apoA-Ⅰ处理24 h的巨噬细胞中L-PGDS mRNA、PGE2和PGD2蛋白的表达均显著高于未用apoA-Ⅰ处理的巨噬细胞( P 均< 0.001);apoA-Ⅰ浓度为50 μg/mL时,作用效果最明显。结论 apoA-Ⅰ的抗AS作用可能与上调THP 1细胞源性巨噬细胞中L PGDS mRNA以及PGE2和PGD2蛋白的表达有关。     

D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达及快速纯化

目的建立简便、快速纯化D-氨基酸氧化酶（DAAO）的新方法，以利用高纯度的DAAO转化头孢菌素C制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸（GL-7ACA）。方法通过基因工程手段，构建N端和C端各镶嵌6个组氨酸的DAAO重组质粒，电转化Pichia pastoris GS115电感受态细胞，利用PCR方法筛选阳性转化子，再经甲醇诱导筛选出高表达菌。结果高表达重组菌（PHD12）摇瓶发酵单位达到2000IU／L，发酵罐内达到22500IU／L。并利用Ni螯合型树脂对表达的DAAO经一步分离纯化，以60％的总收率获得纯化产物。纯化产物保持良好的转化CPC-Na活性。结论利用基因工程表达组氨酸标记蛋白，可简化基因工程的下游工序。     

新型冠状病毒肺炎的免疫失衡及干预策略

冠状病毒是一类在自然界中广泛存在的单链RNA病毒,21世纪头二十年由冠状病毒引起的传染病已在世界范围内引起3次较大规模的流行,加强对冠状病毒的研究势在必行。该文主要以SARS冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及最近在全球爆发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2/2019-nCoV)为例,总结了这些冠状病毒在结构、基因、来源、传染力和致病性等方面的异同,基于实验研究和临床报道,从细胞因子风暴、中性粒细胞异常增多、淋巴细胞亚群失衡等方面阐述了新型冠状病毒肺炎发病的免疫失衡现象以及相应的干预策略,并提出后续展望,为新型冠状病毒肺炎的防治提供新策略和新思路。     

酶抑制剂类抗病毒药物的研究进展

综述了逆转录酶抑制剂、DNA聚合酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、S-腺苷L-高半胱氨酸水解酶抑制剂、单磷酸次黄嘌呤核苷脱氢酶抑制剂和HIV-1整合酶抑制剂的研究进展。     

RGD肽修饰重组高密度脂蛋白载药纳米粒的制备和表征以及肿瘤细胞对其摄取作用

目的：制备和表征RGD肽修饰的重组高密度脂蛋白（RGD—rHDL）载药纳米粒,考察肿瘤细胞对其摄取作用。方法：合成RGD与载脂蛋白AI（ApoAI）的偶联物（RGD—ApoAI）,并以藤黄酸（GA）作为模型药物,采用薄膜分散法制得GA脂质体（LP—GA）,再将RGD—ApoAI与LP—GA共孵育,制备载有GA的RGD—rHDL纳米粒（RGD—rHDL—GA）;随后,对RGD—rHDL—GA进行表征,且采用荧光标记示踪法,通过RGD—rHDL-香豆素-6来考察人肝癌细胞HepG2对载药RGD—rHDL纳米粒的摄取作用。结果：制备的RGD—rHDL—GA呈现规则圆整的类球形,粒径分布均一[（110,70±3．25）nm],Zeta电位为（-39．21±0．10）mV,包封率为（92．20±0．28）％,载药量为（9．03±0．75）％,且其体外释药缓慢,稳定性良好;RGD—rHDL-香豆素-6的肿瘤细胞摄取率明显高于rHDL-香豆素-6。结论：rHDL经RGD修饰后可有效促进所载药物进入肿瘤细胞,提高其肿瘤靶向性。     

D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化.PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500～2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统.