阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。     

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。     

阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1acDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25bp大小的内含子。成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质。结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25bp的内含子。获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究。     

大鼠胰岛B细胞长寿基因SIRT1与转录调节因子FOXO1表达及其相关性研究

目的探讨大鼠胰岛B细胞在衰老进程中长寿基因SIRT1与转录调节因子FOXO1表达的相关性。方法2005年10月至2006年10月,在汕头大学医学院第二附属医院将11只18月龄健康雄性SD大鼠随机分为热量限制(CR)组6只和正常喂养对照组5只,饲养6个月后取胰尾组织,应用免疫组化染色分别检测胰岛中SIRT1、FOXO1和胰岛素表达及分布,衰老相关β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色以反映胰岛B细胞衰老情况。结果SIRT1与FOXO1均可表达于胰岛细胞胞浆、胞核中;β-Gal和胰岛素表达于细胞浆中;与对照组大鼠相比,CR组大鼠胰岛SIRT1表达量较多(P<0.05),衰老相关β-Gal染色强度较弱(P<0.01),胰岛素表达量较低(P<0.05),但FOXO1表达量差异无显著性意义(P>0.05),伴随着SIRT1表达增加,FOXO1胞核阳性率明显降低(P<0.01)。结论热量限制诱导了大鼠胰岛B细胞SIRT1蛋白高表达;SIRT1可能通过抑制FOXO1活性而调控胰岛B细胞的衰老,有利于2型糖尿病的防治。     

阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆和序列分析

Rab鸟苷三磷酸酶是细胞膜转运机制的关键调节分子,与原虫的分泌功能密切相关。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因,以便进一步探讨其功能。作者从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出2个Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆,其中1个cDNA序列长658对碱基,读码框含597对碱基,推测蛋白质序列具198个氨基酸。序列分析表明该氨基酸序列与Rab6a蛋白亚家族的同源性最高。另一cDNA序列长764对碱基,读码框含657对碱基,推测蛋白质序列具218个氨基酸。序列比对分析显示该氨基酸序列与Rab6b蛋白有较高的同源性。2个氨基酸序列都拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域、特异性RabF结构域和典型的异戊烯化结构域。进化树分析提示毛滴虫的这2个基因系Rab6家族的同源基因,在进化上更接近原虫和单细胞的酵母Rab6亚家族。序列分析还显示这2个基因都无内含子,其基因组DNA序列与其cDNA序列完全一致。     

能量限制对化疗大鼠卵巢的形态结构与功能的保护作用

目的探讨能量限制对环磷酰胺处理大鼠卵巢的保护作用。方法将48只10周龄大鼠随机分为对照组、能量限制组、环磷酰胺组、能量限制加环磷酰胺组。观察各组动物的动情周期,实验结束时称取卵巢重量,并进行卵巢组织形态学观察及卵泡计数,测定血清雌二醇、促黄体生成素、促卵泡生成激素评估卵巢储备功能。结果经环磷酰胺处理的大鼠出现精神萎靡、体重下降、动情周期逐渐消失,卵巢体积缩小,颗粒细胞变性、坏死,各期卵泡数均明显减少,闭锁卵泡数增加（P〈0.01）。能量限制组大鼠卵巢的原始卵泡数比对照组明显增多（P〈0.01）,窦状卵泡数减少（P〈0.01）。能量限制加环磷酰胺组的原始卵泡和初级卵泡数比环磷酰胺组明显增多（P〈0.01）,且卵巢组织受损程度较单用环磷酰胺轻。环磷酰胺处理组大鼠血清雌二醇显著低于对照组和能量限制组,促黄体生成素和促卵泡生成素水平则显著高于对照组和能量限制组（P〈0.01）。结论能量限制模型可以抑制原始卵泡的的转化使其数量明显增多,并可以适度减轻化疗造成的结构与功能损伤,使卵巢保留有一定储备功能。     

细粒棘球绦虫疫苗候选分子EgA31的GST融合蛋白原核表达及纯化

目的 :构建细粒棘球绦虫疫苗候选分子EgA31重组质粒 ,表达及纯化EgA31 GST融合蛋白 ,为疫苗的研究奠定基础。方法 :PCR扩增EgA31cDNA ,将得到的cDNA经限制性内切酶酶切 ,然后亚克隆入pGEX 5X 3质粒 ,转化BL2 1宿主菌 ,IPTG诱导重组质粒的表达 ,亲和层析纯化表达产物 ,Bradford法测定重组蛋白含量 ,用SDS PAGE和Westernblot进行分析鉴定。结果 :SDS PAGE显示分离纯化的EgA31 GST融合蛋白为 4 5kDa ,测序检验重组质粒中EgA31cDNA序列正确。EgA31 GST融合蛋白免疫豚鼠得到的抗血清可与细粒棘球绦虫原头蚴总蛋白在 6 6kDa处特异性反应。结论 :EgA31 GST融合蛋白获得高效表达 ,并成功纯化 ,初步实验证明具有良好的免疫原性 ,可用于进一步疫苗的免疫注射实验     

三种库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(ITS2)序列测定与系统进化分析

对广东省野外采集的库蚊属中2个亚属中的3种库蚊,褐尾库蚊Culex fuscanus(Lutzia、路蚊亚属)、二带喙库蚊Cx.bitaeniorhynchus和致倦库蚊Cx.pipiens quinquefasciatus(Culex、库蚊亚属)进行核糖体DNA第二内转录间隔区(ITS2)序列测定,并与GenBank中已知库蚊属中路蚊亚属、库蚊亚属、新库蚊亚属和黑蚊亚属的11种和伊蚊属1种蚊虫的ITS2进行序列分析。结果表明:褐尾库蚊与同亚属的非洲蚊种(Culex tigripes)亲缘关系最近,基因同源性为65.27%;库蚊亚属的二带喙库蚊与伪杂鳞库蚊基因同源性为75.87%;致倦库蚊与尖音库蚊复合组内淡色库蚊的基因同源性97.13%。在所选库蚊中,黑蚊亚属与伊蚊最接近,其次是新库蚊亚属和路蚊亚属的蚊虫。在库蚊属4个亚属中,路蚊亚属与库蚊亚属有更近的亲缘关系,这也印证了库蚊亚属某些幼虫与路蚊亚属幼虫具有相似习性的遗传基础。系统进化关系分析结果与经典分类学分类系统接近一致,但库蚊亚属的进化可能更具多样性。     

白藜芦醇对人食管癌EC109细胞的生长抑制及诱导凋亡作用

背景与目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)抑制人食管癌EC109细胞生长、诱导凋亡的作用机制.材料与方法:不同浓度Res作用EC109细胞后,采用MTF法检测Res对人食管癌EC109细胞生长的抑制作用;Hoechst33258荧光染色和倒置相差显微镜观察EC109细胞的形态学改变;流式细胞术分析细胞周期分布和细胞凋亡.结果:Res(15.62～500 μmol/L)可以抑制人食管癌EC109细胞的生长,且具有时间和剂量依赖性(r=0.918,0.996,P＜0.05、0.01),500 μmol/L Res作用72 h后对细胞的生长抑制率可达87.43%.500 μmol/L Res作用48 h,荧光染色及相差显微镜下可见典型凋亡细胞形态学改变.细胞周期分析显示Res能诱导EC109细胞在S期停滞,抑制细胞DNA的合成并可明显诱导EC109细胞凋亡,凋亡率最高为62.3%.结论:Res可抑制人食管癌EC109细胞生长,引起细胞周期的S期阻滞,并诱导细胞凋亡.     

D-半乳糖致亚急性衰老大鼠的海马衰老信号的改变

目的:研究D-半乳糖(D-Galactose,D-gal)对大鼠海马细胞衰老相关信号的影响。方法:取6月龄雄性SD大鼠30只,平均分成两组,每组15只,D-gal组利用进行D-gal连续腹腔注射(120mg/kg.day),对照组注射同体积的PBS共10周。利用Western blot和免疫组织化学观察SirT1和FoxO3a的表达变化。结果:Western blot和免疫组化结果显示,SirT1在D-gal组表达明显降低(分别为p=0.02,p=0.018);FoxO3a的免疫组化检测发现,D-gal组的海马锥体细胞FoxO3a在胞核的分布明显高于对照组(p=0.002);而相对胞浆的分布却显著降低(p=0.005)。结论:短期给予D-gal能够导致大鼠海马衰老信号的改变。