FANCF-shRNA质粒构建及其对卵巢癌细胞OVCAR3沉默效应的观察

目的:构建针对人FANCF基因的特异性shRNA真核表达载体,体外观察siRNA对卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因的沉默效应。方法:采用基因克隆技术,将设计合成的能表达短发夹RNA的寡核苷酸序列插入真核表达质粒载体pSilencerTM4.1-CMV-neo,构建能表达FANCF-shRNA的真核表达载体;转染人卵巢癌OVCAR3细胞,提取总RNA和蛋白,RT-PCR验证mRNA表达的变化,蛋白质印迹法验证蛋白表达的变化。结果:质粒酶切和测序证实成功构建了FANCF-shRNA的真核表达载体。与野生型OVCAR3相比,脂质体法转染卵巢癌OVCAR3细胞后,FANCFmRNA 24、48和72 h的表达水平与阴性控制组比较均下调,抑制率分别为(23.91±6.58)%(、51.23±5.86)%和(47.42±7.52)%;FANCF蛋白在244、8和72 h的表达水平与阴性控制组比较亦下调,抑制率分别为(16.28±5.46)%(、24.42±6.85)%和(36.05±8.26)%。证实FANCF-shRNA具有沉默OVCAR3细胞FANCF基因表达的效应。结论:siRNA-FANCF干扰可引起卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因沉默,可能为卵巢肿瘤基础和临床研究提供一种有效的方法。     

基于TCGA数据库筛选乳腺癌不良预后相关miRNAs及风险评估

目的基于公用数据库,寻找可作为乳腺癌生物标记物的miRNAs。方法利用人类肿瘤基因组(TCGA)数据库下载乳腺癌相关数据集,分析肿瘤组织与正常组织之间miRNAs的差异表达。Cox单因素回归分析与不良预后相关的miRNAs;对差异表达中上调的有意义的miRNAs进行Cox多因素回归分析,建立风险评估模型。结果与正常组织比较,乳腺癌组织中有370个差异表达miRNAs,其中108个miRNAs表达下调,262个miRNAs表达上调。20个miRNAs的高表达与预后不良相关。进一步建立Cox回归模型筛选出10个miRNAs组合(包括hsa-mir-148b、hsa-mir-449c、hsa-mir-106a、hsa-mir-181d、hsa-mir-9-3、hsa-mir-549a、hsa-mir-556、hsa-mir-618、hsa-mir-466、hsa-mir-135a-1)预测乳腺癌不良预后。结论筛选的10个miRNAs组合(ten-miRNAs)的高评分可成为预测乳腺癌不良预后的生物标记物。     

FANCF-shRNA 表达质粒的构建及MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型的建立

 目的构建针对人FANCF基因的shRNA 表达质粒（ FANCF-shRNA）,转染FANCF-shRNA 使人乳腺癌MCF-7 细胞
FANCF基因沉默,从而建立MCF-7--RNAi瞬时转染细胞模型。方法实验分两部分： FANCF-shRNA 表达质粒的构建：
根据相关文献报道,使用Ambion 公司的在线设计软件,设计并合成能够编码针对FANCF基因的小发夹RNA（ FANCF-shRNA）
的DNA 模板,将其插入到p SliencerTM 4.1-CMV neo 表达质粒中,形成pSliencerTM 4.1-CMV-FANCF-shRNA 重组质粒;将该重组
质粒转化到感受态细胞JM109 中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增;通过PCR 及FANCF基因
测序方法筛选出插入正确的FANCF-shRNA 表达质粒;MCF-7--RNAi 瞬时转染细胞模型的建立：碱裂解法提取-
shRNA 表达质粒,通过脂质体介导将该质粒转染入人乳腺癌MCF-7 细胞中,RT-PCR 法检测FANCF基因mRNA 表达水平,确
认FANCF基因沉默。结果含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR 扩增片段约为250 bp,并且其FANCF基因测序结果显示插入片段碱
基排列顺序正确,没有突变,说明FANCF-shRNA 表达质粒构建成功;与阴性对照组相比,转染FANCF-shRNA 质粒后第2 天、
第3 天、第5 天和第7 天, FANCF基因mRNA 表达水平均明显减低,表达抑制率分别为（36.51±6.84）%、（37.03±6.61）%、
（53.03±9.33）%和（39.51±10.13）%（ 约0.05）,说明FANCF基因沉默,MCF-7--RNAi 瞬时转染成功建立。结论成功构
建了FANCF-shRNA 表达质粒并建立MCF-7--RNAi 细胞模型,为研究FANCF基因在乳腺癌发生发展及耐药产生与调控
中的作用奠定实验基础。     

ω-3鱼油脂肪乳对辐射损伤小鼠造血系统保护作用的研究

目的研究ω-3鱼油脂肪乳对电离辐射引起小鼠骨髓损伤的影响,旨在阐明ω-3鱼油脂肪乳对辐射性造血损伤的保护作用。方法采用直线加速器一次性6.0 Gy全身照射ICR小鼠,建立辐射损伤小鼠模型。取各组小鼠外周血用于白细胞(WBC)和血小板(PLT)计数,取骨髓进行瑞氏-吉姆萨染色观察骨髓象改变,流式细胞术检测骨髓细胞凋亡百分率,免疫细胞化学检测骨髓细胞凋亡抑制因子BCL-XL的表达。结果与空白对照组(BC组)相比,生理盐水组(NS组)小鼠外周血WBC和PLT计数均明显减少(P<0.05),骨髓增生降低,早期及晚期凋亡率显著增加(P<0.05),凋亡抑制因子BCL-XL表达降低;与生理盐水组相比,ω-3鱼油脂肪乳(ω-3组)可显著提高小鼠外周血WBC和PLT计数(P<0.05),促进骨髓增生,抑制骨髓细胞凋亡率(P<0.05),增加凋亡抑制因子BCL-XL的表达。结论ω-3鱼油脂肪乳可以促进骨髓造血系统恢复,对辐射导致的造血系统损伤具有良好的保护作用。