重组人白细胞介素12的纯化与鉴定

目的探索重组人白细胞介素12(rhIL-12)的纯化与鉴定方法。方法采用Millipore超滤浓缩系统对含rhIL-12的无血清培养上清进行浓缩,用阴离子交换色谱柱,阳离子交换色谱柱和尺寸排阻色谱柱纯化出rhIL-12;并对rhIL-12的纯度、活性及氨基酸序列进行检测。结果纯化后产物经Western blot鉴定(P35、P40)为rhIL-12,毛细管电泳法测得其纯度在98%以上;生物学活性达8.0×106IU/mg,且氨基酸序列与已报道的序列相一致。结论建立了获得高纯度、高生物活性的rhIL-12的纯化与鉴定方法。     

可激活人γδT细胞的结核杆菌耐热多肽抗原的初步纯化与活性鉴定

目的：对结核杆菌耐热多肽抗原（Mtb-Ag)的蛋白组成进行定性分析。并观察Mtb-Ag及其纯化组分刺激人外周血γδT细胞和αβT细胞增殖反应的量效关系。方法：用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）定性分析Mtb-Ag 的蛋白组成，并用不同剂量的Mtb-Ag及其纯化组分体外刺激健康人外周血PBMC，培养9d后经流式细胞仪检测细胞表型。结果：Mtb-Ag经FPLC Mono Q离子交换柱分析存在20种蛋白成分，Mtb-Ag在合适刺激剂量时对人γδT细胞发挥优势扩增，当剂量过大则对αβT细胞发挥优势扩增，其分离纯化的含大分子蛋白的蛋白峰Ⅰ随着刺激剂量增加而对αβT细胞的扩增表现显著增强趋势；而其分离的含低分子多肽的蛋白峰Ⅱ随着刺激量增加则对γδT细胞扩增表现显著增强趋势，并且其活性明显高于蛋白峰I，同时其对αβT细胞的扩增效应并不明显，并显著低于Mtb-Ag和蛋白峰I。结论：Mtb-Ag刺激γδT细胞扩增时应选择合适的刺激剂量，其所含的低分子多肽抗原能特异性激活γδT细胞，而其所含的大分子蛋白抗原则特异性激活αβT细胞。     

刺激人γδ+T细胞增殖的结核杆菌多肽抗原的纯化与活性鉴定

目的：纯化可刺激人γδ^ T细胞增殖的结核杆菌耐热多肽抗原。方法：采用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）S-100分子筛层析柱，对结核杆菌耐热抗原（Mtb-Ag)初步分离，将获得的结核杆菌耐热Mr低的多肽抗原（Mtb-LW-Ag)洗脱峰，分别再经FPLCMonoQ离子交换层析柱进一步纯化，并且采用流式细胞仪对获得的Mtb-LW-Ag进行刺激γδ^ T细胞增殖活性的测定。结果：Mtb-Ag经FPLCS-100柱可分离出1个大分子蛋白峰A和3个Mr低的多肽峰（B，C，D），Mr低的多肽峰分别糨MonoQ柱层析，鉴定出B峰含有6个主峰，C峰含有1个主峰，D峰含有8个主峰，对Mtb-LW-Ag及其纯化多肽进行活性检测，发现多肽峰B和C以及纯化多肽B-Ⅲ和C-主肽均可显著刺激γδ^ T细胞扩增。结论：利用FPLC法可快速高效地从Mtb-Ag中纯化出多种Mr低的多肽，而且其中的B-Ⅲ多肽的C-主肽可能是促进γδ^ T细胞活化增殖的主要多肽。     

重组人白细胞介素-18的高浓度复性、纯化和活性检测

目的摸索大规模生产重组人白细胞介素 18(rhIL 18)高效简便、成本低廉的生产工艺。优化rhIL 18高浓度下最优复性、纯化方案 ,建立快速准确的活性检测方法。方法采用液相色谱和光谱学方法检测复性效率 ,筛选确定rhIL 18最优复性条件 ,再用SepheroseFFANX阴离子交换柱结合分子筛HiPrepSephacrylS 10 0进行纯化。采用3 H 掺入法检测rhIL 18产品对人外周血单个核细胞的促增殖作用 ,用流式细胞术检测其促γ 干扰素生成能力。结果建立了一套rhIL 18复性、纯化、活性检测方案。结论液相色谱和光谱学方法相结合 ,可用于检测rhIL 18的复性效率 ,流式细胞术也可用于检测rhIL 18的生物活性。