土木香内酯抗病毒作用的体内外研究

目的 探索土木香内酯体内外的抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)通路探究其抗病毒作用机制。方法 CCK-8法检测土木香内酯对A549细胞活力的影响;利用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,VSV-GFP)感染细胞模型,结合流式细胞术检测土木香内酯对病毒复制的影响;qRT-PCR检测土木香内酯对甲型流感病毒(influenza A virus,H1N1)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)复制的影响;Western blotting检测土木香内酯对VSV病毒G蛋白和H1N1病毒NP蛋白表达的影响;利用生物信息学初步分析土木香内酯的抗病毒分子机制;qRT-PCR检测药物处理后干扰素α1(interferon α1,Ifna1)、干扰素β1(interferon β1,Ifnb1)、干扰素诱导蛋白1(interferon-induced protein with tetratrico...     

千金藤素抗病毒作用的免疫学机制研究

目的 探索千金藤素体内外的抗病毒作用,并基于抗病毒天然免疫通路探究其抗病毒作用的分子机制。方法 CCK-8 法检测千金藤素（0.062 5～64.000 0 μmol·L^-1）对 A549 细胞活力的影响;利用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-GFP）感染 A549 细胞模型,结合流式细胞术检测千金藤素对病毒复制的影响并探究预处理、吸附过程及吸附后加药对 VSV-GFP 病毒复制的影响;实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测千金藤素对甲型流感病毒（H1N1）、脑心肌炎病毒（EMCV）和单纯疱疹病毒 I 型（HSV-1）复制的影响;构建 VSV 感染小鼠模型探究千金藤素的体内抗病毒作用;A549细胞中利用生物信息学方法探究其抗病毒机制;qRT-PCR 检测药物处理 A549 和原代胚胎成纤维细胞（MEF）后 IFNB1 及干扰素刺激基因 （ISGs） 表达变化;免疫印迹法 （Immunoblotting） 检测人源单核细胞白血病细胞（THP-1）中 TBK1 和STAT1 的磷酸化水平。结果 与模型组相比,千金藤素在 A549 细胞中显著抑制 VSV、H1N1、EMCV 和 HSV-1 复制;千金藤素不影响 VSV 的吸附过程,而预处理或吸附后给药可以显著抑制病毒复制;千金藤素提高 VSV 感染小鼠的存活率;千金藤素激活基于IFN-I通路的抗病毒天然免疫应答。结论 千金藤素通过激活基于IFN-I通路的抗病毒天然免疫发挥体内外抗病毒作用。     

小檗胺的体外抗病毒作用及基于Ⅰ型干扰素通路的机制研究

目的 观察小檗胺的体外抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）通路的抗病毒天然免疫反应探讨其作用机制。方法 CCK-8法检测0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000 μmol·L^-1的小檗胺对A549细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-GFP）以0.05的感染复数（MOI）感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12 h的小檗胺2.5、5.0、10.0 μmol·L^-1对GFP阳性细胞比例的影响;VSV感染A549细胞,Western blotting检测小檗胺对VSV病毒G蛋白表达的影响;小檗胺使用预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10 h 3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-GFP在A549细胞中复制的影响;分别使用甲型流感病毒（H1N1）（MOI＝0.05）,脑心肌炎病毒（EMCV）（MOI＝3）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）（MOI＝1）感染A549细胞,同时给药共同孵育12 h后,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测小檗胺对病毒RNA表达的影响;小檗胺10.0 μmol·L^-1处理A549细胞24 h,进行转录组测序分析;10 μmol·L^-1小檗胺处理MEF细胞12 h后,qRT-PCR法检测Ifnb1、Ifit1、Ifit2、Ifi44基因的mRNA表达;利用IFN刺激性DNA （ISD）转染THP-1细胞,预先激活IFN-I信号通路,4～6 h加入小檗胺5、10 μmol·L-1处理12 h,qRT-PCR法检测IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因的mRNA表达。结果 浓度为10 μmol·L^-1及以下时,小檗胺对A549细胞均未显示出明显的细胞毒性;与模型组相比,小檗胺剂量相关性地减少了VSV-GFP阳性细胞的比例（P＜0.05、0.001）,明显减少了病毒的VSV-G蛋白表达;小檗胺对VSV的吸附过程没有影响,而预处理或吸附后给药可以显著抑制病毒复制;与模型组比较,小檗胺剂量相关性地抑制了H1N1、EMCV和HSV-1的病毒基因表达（P＜0.001）;转录组测序和qRT-PCR结果表明,小檗胺促进细胞基于IFN-I信号通路的抗病毒免疫激活;在ISD刺激后,小檗胺诱导更高水平的IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44 mRNA表达（P＜0.05、0.01、0.001）。结论 小檗胺可能通过促进基于IFN-I通路的抗病毒天然免疫反应抑制多种病毒复制。