生物化学与细胞生物学课程整合的探讨

为了适应新世纪教学内容和课程体系改革的要求,我校借鉴美国哈佛大学医学院的经验,将生物化学与细胞生物学两门课程整合为“细胞的化学与生物学”。整合后在减少两个学科间重复内容、增加学科间联系、减少学时、早期接触临床、培养学生分析解决问题的能力、创新能力等方面有了很大改进,为这两门课程的改革开辟了新途径。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

MAPK和MPF对小鼠受精卵有丝分裂期作用

目的探讨有丝分裂促进因子（MPF）和丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）在小鼠受精卵第一有丝分裂期（M期）中的作用及相互关系.方法分别用MAPK激酶特异性抑制剂（U0126）和MPF特异性抑制剂（roscovitine）抑制受精卵细胞MAPK和MPF的活性,通过同位素测定MAPK和MPF的活性变化,利用显微镜进行形态观察来判定MAPK活性变化对受精卵发育的影响.结果在受精卵第一次有丝分裂期,正常组小鼠受精卵MAPK和MPF的活性均有短暂升高.在U0126处理组,MAPK的活性受抑制会导致受精卵处于M期而不发生分裂,但MPF的活性未受到影响.在roscovitine处理组,MPF的活性受到抑制导致受精卵处于M期不发生分裂,此时MAPK不发生活化.结论 MAPK和MPF的活化对于小鼠受精卵完成有丝分裂是不可缺少的,在有丝分裂期MPF参与MAPK的活化.     

猪胆酸钠对人早幼粒白血病细胞系(HL-60)作用机理的初步探讨

观察了猪胆酸钠和维甲酸对人早幼粒白血病细胞系(HL-60)体外诱导分化过程中细胞膜脂肪酸的组成、细胞蛋白激酶C(PKC)活性及c-myc癌基因表达的变化,初步探讨猪胆酸钠对HL-60细胞作用的分子机理,结果表明,经100～400μg·ml~(-1)猪胆酸钠处理3d的HL-60细胞,其PKC活性和c-myc表达与对照组比较均明显下调;1μmol·L~(-1)维甲酸诱导3 d的细胞,PKC活性未见明显变化,而癌基因c-myc表达则降至对照组的17％;无论是猪胆酸钠(400 μg·L~(-1))还是维甲酸(1μmol·L~(-1))诱导3d的HL-60细胞,其细胞膜脂肪酸组成均无明显改变。     

升主动脉缩窄心衰大鼠心肌PKC活性测定

目的：探讨升主动脉缩窄慢性压力后负荷心肌肥厚转变为心力衰竭过程中心肌蛋白激酶C（PKC）比活性的变化及意义。方法：用泰夫隆管环扎幼鼠升主动脉，制作慢性压力后负荷心肌肥厚－心力衰竭模型。据改良Takai放射性核素酶解测定法，应用γ－^32P-ATP测定不同病理时期心肌组织中PKC比活性。结果：与假手术组比较，肥厚组心肌胞膜、胞浆PKC比活性明显增高（P＜0．01）、PKC膜／浆比值明显增加（P＜0．01）；心力衰竭组心肌胞膜、胞浆PKC比活性差异均无显著性（P＞0．05），但PKC膜／浆比值明显增加（P＜0．01）。结论：PKC亚细胞水平的活性变化在慢性压力后负荷心肌肥厚－心力衰竭的转变中起重要的调控作用。     

mTOR/P70 S6激酶信号通路在腮腺腺癌发生中和作用

目的:研究mTOR/P70 S6激酶信号通路激活在腮腺腺癌发生中的作用.方法:用免疫组织化学方法及Western印迹分析测定腮腺腺癌中mTOR和P70 S6激酶的表达.结果:免疫组化与Western印迹分析的结果一致,与正常组织相比,腮腺腺癌中mTOR和P70 S6激酶的表达明显增加.结论:口腔腮腺腺癌mTOR和P70 S6激酶的表达增加可能是介导腮腺腺癌发生的主要机制之一.     

肌醇多磷酸5-磷酸酶(PIPP)在人下咽癌组织的表达及临床意义

目的研究肌醇多磷酸5-磷酸酶(PIPP)在人下咽癌中的表达,探讨其临床意义。方法对15例人下咽癌组织学标本和15例正常的癌旁组织进行免疫荧光和免疫印迹检测。结果 PIPP的表达量及荧光强度在下咽癌组织中明显低于正常组织。结论 PIPP在下咽癌组织中低表达可能为临床提供新的诊断指标。     

蛋白激酶C亚型在涎腺腺样囊性癌中的表达

目的：探讨蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）与涎腺腺样囊性癌（ＳＡＣＣ）发生发展的关系。方法：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ技术对ＰＫＣ５种亚型α,βⅠ,βⅡ,ε,δ在该肿瘤亚细胞水平的表达进行研究。结果：（１）ＳＡＣＣ及临近正常组织胞浆中均可见ＰＫＣ－α、ＰＫＣ－βⅠ,ＰＫＣ－βⅡ的表达,与临近正常组织相比,肿瘤组织胞浆中上述３种ＰＫＣ亚型表达明显降低（Ｐ〈０．０１）;（２）临近正常组织胞膜中未见ＰＫＣ     

p21-EGFP 融合基因表达载体与卵母细胞的表达定位

目的:通过构建绿色荧光蛋白p21-EGFP融合基因表达载体,观察其在小鼠卵母细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对小鼠卵母细胞细胞周期的影响提供实验基础.方法:以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21cDNA , 应用基因重组技术与EGFP 基因融合, 构建以绿色荧光蛋白EGFP为报告基因的重组表达质粒pEGFP-p21.利用显微注射方法注射到小鼠卵母细胞中进行表达,用荧光显微镜直接观察pEGFP-p21融合蛋白在细胞中的分布和定位, Western Blot 方法检测其蛋白的表达.经酶切证实插入片断的正确性.结果:荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP-C3转染的小鼠卵母细胞中,绿色荧光呈弥散分布,而经注射重组质粒pEGFP-p21 的小鼠卵母细胞中, 绿色荧光主要集中在细胞核内.同时用Western Blot 证实了pEGFP-p21 融合基因的表达.结论:成功的构建了pEGFP-p21 融合表达质粒.同时证明小鼠卵母细胞能高效表达pEGFP-p21 融合基因, 且主要定位于细胞核内.