小干扰RNA对人视网膜色素上皮细胞缝隙连接蛋白43表达水平的调节

目的 观察体外化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原代培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,cx43)基因和蛋白表达的影响.方法 设计合成针对人ex43基因的小干扰片段(siR-NA1、siRNA2、siRNA3)和1条阴性对照siRNA0,在脂质体的介导下转染培养的人RPE细胞,采用RT-PCR确定最有效的抑制片段;针对siRNA的有效片段,分为不同浓度(50～30nmolO·L-1)转染培养细胞,培养72 h后进行MTT增生试验,观察其对人RPE细胞增生能力的影响,确定最有效的浓度;siRNA转染细胞后,分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后进行Weston blot试验.观察不同时间点其对cx43蛋白表达的影响.结果 体外合成的3条siRNA均在一定程度上抑制cx43基因的合成,其中 siRNA1是最有效的抑制片段,根据条带灰度比其抑制率达到72%;siRNA1可以显著促进人RPE细胞的增生,增生率达到146%;明显抑制其cx43蛋白的表达(P<0.01),抑制率达到61%;从浓度组间结果可以看出,siRNA的最佳作用浓度是250 nmol·L-1,在此浓度之前效率与浓度呈正比,超过此浓度后各浓度组间差异无统计学意义;比较不同时间点,siRNA转染人RPE细胞24 h后开始抑制cx43表达,48 h后对cx43蛋白合成抑制率最明显.结论 化学合成的siRNA可以有效抑制培养的人RPE细胞cx43基因的表达,促进细胞的增生.这种基因沉默作用可能对于视网膜色素上皮组织的再生有一定作用.