葡萄糖调节蛋白78对肝癌细胞放射敏感性的调控作用及其机制

目的:探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对肝癌细胞放射敏感性的影响,初步阐明其分子机制.方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测肝癌SMMC-7721、HepG2、PLC、Huh7和QGY-7703细胞中GRP78 mRNA和蛋白表达水平,筛选GRP78高表达和低表达的...     

肥胖MC4R重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建黑素皮质素受体-4（MC4R）重组腺病毒表达载体,为肥胖症的基因治疗研究奠定基础。方法 PCR扩增犬MC4R目的基因后与T载体连接,双酶切鉴定正确的T-A载体获得具有黏性末端的MC4R目的基因;将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,构建穿梭载体pShuttle-CMV/MC4R;PmeⅠ单酶切pshuttle-CMV/犬MC4R后,转化到含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,采用细菌内同源重组法构建腺病毒载体pAdeasy-1/pshuttle-CMV/MC4R;筛选阳性克隆子;PacⅠ酶切鉴定。结果线性化的pShuttle-CMV/MC4R转化含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,16 h后获得阳性克隆子,经PacⅠ酶切鉴定出一大于20 kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,通过BglⅡ、XhoⅠ双酶切切下约1000 bp的片段,含MC4R目的基因的重组腺病毒载体构建成功。结论细菌内同源重组法可高效、快捷的制备含犬MC4R的重组腺病毒载体;该载体为人类肥胖症的基因治疗研究奠定了基础。     

金属蛋白酶ADAM10在胶质瘤中的表达及意义

目的 探讨ADAM10基因mRNA及蛋白在胶质瘤细胞中的表达及生物学意义.方法 我院2007年6月至2010年7月共计43例脑胶质瘤患者标本,低级别胶质瘤22例,高级别胶质瘤21例,取脑膜瘤5例作为阴性对照组,采用RT-PCR、免疫组织化学实验方法检测ADAM10基因及蛋白的表达,进行半定量分析和细胞形态学观察.结果 单因素方差分析三组平均灰度值结果如下:阴性对照组为4.8,低级别组为22.1,高级别组为32.3,高级别组和低级别组比较差异有统计学意义(P＜0.05),低级别组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);免疫组化染色提示蛋白主要定位于肿瘤细胞膜、瘤组织内血管壁上.结论 胶质瘤恶性度越高,肿瘤侵袭性越强,ADAM10表达也越多,推测其可能参与胶质瘤侵袭生长;ADAM10同时也在血管壁上有较多表达,推测其可能与瘤周水肿形成有关.     

Grp78用于胸部良恶性肿瘤鉴别诊断的实验研究

目的探讨分子伴侣Grp78用于胸部良恶性肿瘤鉴别诊断的可能性。方法应用免疫印迹技术对36例疑似肺癌病人胸水脱落细胞中Grp78的表达水平进行检测，并将检测结果与胸水脱落细胞学检查结果和临床病理资料对照。结果免疫印迹结果表明Grp78高表达的21例病人，经过临床观察和病理学检查，有19例被临床诊断为肺癌，GW7S表达水平较低15例病人中，没有病例被诊断为肺癌，灵敏度为90％，特异度为85．7％；而应用传统的检测方法对36例肺癌疑似病人胸水进行脱落细胞学检查，有12例病人怀疑为肺癌，经过临床及病理学检查有4例被排除，灵敏度为47％，特异度为85％。结论检测肺癌疑似病人胸水脱落细胞中Grp78的表达水平可以提高肺癌鉴别诊断的灵敏度，有利于胸部恶性肿瘤的早期诊断及鉴别诊断。     

川芎嗪对中波紫外线诱导黑素细胞黑素生成的影响

目的:研究川芎嗪(TMP)对不同剂量中波紫外线(UVB)诱导正常人黑素细胞黑素合成的影响,并初步探讨其机理。方法:常规分离培养正常人黑素细胞,分别用30mJ/cm2、90mJ/cm2的UVB照射细胞,然后加入100μg/ml、300μg/ml、600μg/ml的TMP孵育至72h,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖情况;多巴氧化法测定酪氨酸酶活性;NaOH裂解法测定黑素含量。结果:30mJ/cm2的UVB能诱导黑素细胞增殖,加强酪氨酸酶活性,促进黑素生成,TMP能显著抑制该效应,并呈剂量依赖性;90mJ/cm2的UVB对黑素细胞产生明显的细胞毒作用,细胞增殖下降,黑素合成减少,TMP则能减轻其细胞毒作用,并也表现为剂量依赖性,以600μg/ml的TMP作用最为显著,差异有统计学意义。结论:TMP不但能抑制低剂量UVB照射诱导的黑素细胞增殖和黑素合成,而且还能减轻高剂量UVB照射对黑素细胞的细胞毒作用,对黑素细胞起一定的光保护作用。     

肝细胞生长因子对肝细胞癌侵袭和转移的影响

目的:研究HGF对肝细胞癌SMMC-7721的上皮-间叶转化的作用,并对其机制进行探讨.方法:HGF处理SMMC-7721后,应用细胞培养、Transwell、划痕实验、WB技术研究HGF对肝癌细胞SMMC-7721上皮-间叶转化的作用.并应用P13 kinase抑制物LY294002 10umol/L顸处理细胞,观察SMMC-7721的变化,研究P13 kinase对于HGF作用机制的影响.结果:Transwell和划痕实验显示HGF处理的细胞侵袭和转移能力增强,蛋白印迹结果显示HGF处理的细胞的N-cad、MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达增加,E-cad的表达减少.LY294002预处理后,细胞不再受HGF的影响,细胞的形态没有明显变化.Transwell和划痕实验结果与未经处理的SMMC-7721相同.蛋白印迹结果显示:细胞的N-cad、MMP.2、MMP-9、Vimacntin和E-cad的表达变化不明显.结论:HGF能够促进SMMC-7721的上皮间叶转化,这种作用通过PD Kinase实现.     

FAK、FAKpY397和Src在肝细胞癌中的表达和意义

目的：探讨黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）、磷酸化黏着斑激酶（phospho-FAK Y397,FAKpY397）和类固醇激素受体共活化因子（sceroid recptor coactivator,Src）在不同分化程度肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达情况以及三者的相关性。方法：通过免疫组织化学法和人工计数法检测44例HCC组织及8例癌旁正常肝脏组织中FAK、FAKpY397和Src的表达。结果：FAK、FAKpY397和Src在HCC组织中表达均高于正常肝脏组织（P=0.027、P=0.041、P=0.030）且三者均与HCC分化程度有关（P=0.026、P=0.045、P=0.005）,FAK和Src低分化组阳性率高于高分化组（P=0.015、P=0.002）。HCC组织中三者表达两两之间呈正相关（P=0.000、P=0.000、P=0.000）。结论：HCC组织中FAK、FAKpY397和Src表达与HCC分化程度有关;FAK和Src低分化组阳性率高于高分化组且三者相互之间存在一定相关性。     

E-cadherin和HSP70在肝细胞癌中的表达

目的:探讨E-cadherin和HSP70在不同分化程度HCC中的表达情况以及两者的相关性。方法:采用免疫组织化学方法,检测41例肝癌组织及5例癌旁正常肝脏组织中E-cadherin和HSP70的表达情况。结果:E-cadherin在正常肝脏组织中呈高表达,而在HCC中表达降低且与分化程度有关,部分低分化的HCC组织中表达缺失(P<0.05);HSP70在HCC中表达升高,与正常组比较差异有显著性,且与分化程度有关。相关性分析发现E-cadherin和HSP70在HCC中的表达成负相关(r=-0.322,P<0.05)。结论:HCC中,E-cadherin表达降低,HSP70表达升高,提示两者在HCC侵袭和转移中存在一定的相关性。     

人GRP78蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的:构建原核表达质粒pGEX-4T-1 -GRP78,诱导表达、纯化后检测GRP78蛋白的抗原活性.方法:利用PCR方法从本实验室已构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)上扩增GRP78基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组载体pGEX-4T-1 -GRP78.转化至大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin切割;进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价.结果:酶切和测序结果均证实GRP78原核表达载体构建正确,可诱导表达;ELISA检测显示纯化后的人GRP78抗原具有免疫原性.结论:成功构建了人GRP78基因的原核表达载体,获得了纯化的GRP78蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以GRP78为基础的肝细胞癌的血清学检测提供了抗原.