脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白融合基因载体的构建、鉴定及初步应用研究

目的 构建脑源性神经营养因子(BDNF)绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,观察其融合蛋白的特性.方法 将BDNF cDNA片段插入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO真核表达质粒,使其与GFP同处一个阅读框架中,测序鉴定后,转染培养的雪旺细胞,用免疫组织化学和蛋白质印迹(Western botting)观察外源性目的 蛋白的表达情况,并用该质粒活体转染视神经切断的大鼠模型,观察所表达外源性蛋白的神经保护作用.结果 测序证实质粒构建成功.Western botting结果 显示.BDNF-GFP融合蛋白表达一相对分子质量为41×103大小条带.荧光显微镜下可见BDNF-GFP转染的细胞发出绿色荧光,免疫组织化学染色后,可见绿色荧光与红色荧光完全重合.转染BDNF-GFP质粒和GFP质粒的大鼠视神经切断术后7d存活视网膜神经节细胞(RGC)分别为(1201±286)、(482±151)个/mm2,存活百分比分别为(51.39±12.24)%和(20.62±6.46)%;28 d时存活的RGC分别为(715±71)、(112±24)个/mm2,存活百分比分别为(30.59±3.04)%和(4.79±1.03)%.两组存活百分比比较,差异有统计学意义(t=3.144,11.378;P<0.01).结论 BDNF-GFP融合表达载体可以转录翻译为一融合蛋白,该蛋白可自发绿色荧光,并具有BDNF的生物学活性.     

LPS活化的小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞VEGF及ZO-1表达的影响

目的研究活化的小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和ZO-1表达的影响。方法原代培养视网膜小胶质细胞，纯化鉴定后分为三组：A组，空白对照组；B组，未激活的小胶质细胞组；C组，100ng／mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活的小胶质细胞组，然后采用Transwell小室与HUVECs共培养。用免疫荧光染色观察各组HUVECs紧密连接蛋白ZO-1的表达，并用Western Blot方法检测各组细胞VEGF和ZO-1的表达。结果细胞免疫荧光染色结果显示，LPS活化的小胶质细胞作用于HUVECs后，HUVECs的ZO-1表达明显低于未活化的小胶质细胞作用组和空白对照组。Western Blot结果亦显示，LPS活化的小胶质细胞作用组ZO-1的表达明显低于未活化的小胶质细胞作用组和空白对照组（P〈0．05），而VEGF表达则高于未活化的小胶质细胞作用组和空白对照组（P〈0．05）。结论活化的小胶质细胞影响血管内皮细胞表达VEGF和ZO-1，可能是导致屏障功能破坏的重要机制之一。     

试题与答案

1．对多发性硬化患者按下列哪项方法治疗，其患眼和对侧眼的复发率均最高？ A．口服泼尼松治疗； B．静脉滴注甲泼尼龙冲击疗法； C．静脉滴注甲泼尼龙＋口服泼尼松维持；     

新型冠状病毒感染后急性黄斑神经视网膜病变临床及多模式影像特征分析

目的观察新型冠状病毒感染(COVID-19)相关急性黄斑神经视网膜病变(AMN)患眼的临床和多模式影像学特征。方法回顾性研究。2022年12月20日至2023年1月17日在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科就诊的COVID-19相关AMN患者29例58只眼纳入研究。所有患眼均行最佳矫正视力、眼底彩色照相、红外眼底照相(IR)、短波长自身荧光(SW-AF)、近红外自身荧光(NIR-AF)、光相干断层扫描(OCT)、OCT血管成像(OCTA)检查。所有患者均予以改善微循环口服药物治疗;其中, 联合小剂量糖皮质激素口服12例。首诊后随访1～3个月, 完成1个月随访共19例38只眼。结果 29例患者中, 男性9例18只眼, 女性20例40只眼;均为双眼发病。患者年龄(29.9±9.5)(12～47)岁。发热至出现眼部症状的时间为(2.52±2.01)d。58只眼中, 合并视网膜棉绒斑、视盘水肿、黄斑旁视网膜分支静脉阻塞分别为5、2、1只眼。所有患眼可见深红棕色黄斑暗区。IR检查, 中心凹和旁中心凹楔形、类楔形或"花瓣样"斑片状暗区。SW-AF检查, 未见明显异常39只眼;与IR一致的弱自身荧光暗区...     

脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白融合基因载体的构建、鉴定及初步应用研究

Objective To construct expression plasmid of the fusion protein of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-green fluorescent protein (GFP), and observe its characteristics. Methods BDNF cDNA segment was inserted into plasmid pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO and in the same reading frame with GFP. After verified by sequencing, the BDNF-GFP plasmid was transferred into cultured Schwann cells by electroporation. And the expression of BDNF-GFP fusion protein was observed by immunohistochemistry and Western blotting. The neural-protective function of the fusion protein was evaluated by transferring the plasmid into adult rat retinas with transected optic nerve. Results The sequence of BDNF-GFP plasmid was verified correctly by auto-sequencing. The results of Western blotting showed that the BDNF-GFP fusion protein expressed a brand with the relative molecular mass of 41×103. Seven days after the optic nerve was transected, the number of survival retinal ganglion cells (RGC) in BDNF-GFP group and GFP group was (1201±286) and (482±151) cells/mm2, respectively; and the survival rate was (51.39±12.24)% and (20.62±6.46)%, respectively. Twenty-eight days after the optic nerve was transected, the number of survival RGC in the two groups was (715±71) and (112±24) cells/mm2, respectively; the survival rate was (30.59±3.04)% and (4.79±1.03)% respectively. The differences of the survival rate of RGC between the two groups were significant (t=3. 144, 11.378; P<0.01). Conclusion BDNF-GFP fusion plasmid can express a fusion protein which emit green fluorescence and has the biological activity of BDNF.