内源性大麻素对缺氧缺糖视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景 急性视网膜缺血缺氧性损伤在眼科较为常见,如青光眼急性发作、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变等,可引起视网膜的缺血缺氧损伤,并可致视网膜神经节细胞(RGCs)的死亡.内源性大麻素(CB)及其受体(CBR)参与中枢神经系统外伤、缺血、炎症及中毒等多种生理病理过程. 目的 探讨视网膜神经节细胞(RGCs)在缺氧缺糖损伤中内源性CB的作用及意义.方法 取6周龄正常C57BL/6J小鼠眼球,制备小鼠视网膜垂直冰冻切片,采用免疫荧光染色法检测和验证CB1R和CB2R在RGCs中的表达.10只C57 BL/6J新生鼠浸入75％乙醇消毒后取眼球,在冰上预冷的DMEM培养基中分离视网膜进行RGCs原代培养,采用免疫荧光技术检测培养细胞中RGCs标志物Brn3a的阳性表达并确定培养细胞中CB1R和CB2R的表达.将原代培养14 d的RGCs分为正常对照组和氧糖剥夺(OGD)组,分别用完整培养基+体积分数95％空气+体积分数5％ CO2和无糖培养基+体积分数95％ N2+4％ CO24+体积分数1％ O2条件下培养20 h.采用JC-1染色法检测细胞中线粒体结构变化和RGCs的形态变化.各组细胞分别给予1μmol/L CB1R拮抗剂SR141716A、1μmol/L CB2R拮抗剂SR144528以及5μmol/L、10 μmol/L CB1R和CB2R激活剂WIN 55212-2,采用MTT法比较各组RGCs存活率.结果 正常C57BL/6J小鼠视网膜全层均可见CBR的表达.正常对照组培养的RGCs大小均匀,多呈多角形,细胞间轴突细长并形成网络,细胞中Brn-3a表达阳性;OGD组培养的细胞皱缩或形成碎片,多数细胞轴突消失,Brn-3a表达荧光强度明显减弱.正常对照组RGCs中JC-1染色显示,线粒体的黄色荧光明显强于OGD组,表明OGD组线粒体膜电位明显下降.MTT法检测显示,正常对照组RGCs存活率为(100.00±13.87)％,明显高于OGD组的(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=8.065,P=0.008);SR141716A和SR144528作用后OGD组细胞存活率分别为(116.63 ±22.21)％和(112.61±19.02)％均明显高于同组的无药物处理细胞的存活率(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=29.780、17.391,均P＜0.01),而SR141716A和SR144528作用后正常对照组细胞存活率的变化差异均无统计学意义(均P＞0.05). 结论 细胞缺氧缺糖时上调CB在细胞中的表达和激活CB活性.在缺氧缺糖条件下,抑制细胞中CBR的激活过程对RGCs有保护作用.