EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。     

眼科互联网护理咨询门诊的探索与实践

目的：通过中山大学中山眼科中心眼科互联网护理咨询门诊建设与运营经验,对互联网专科护理服务模式及效果进行分析,为眼科互联网+护理服务提供参考。方法：依托医院优质资源,成立眼科互联网护理咨询门诊;根据眼科患者的实际需求,制订互联网护理咨询门诊服务制度、工作流程,对出诊专家进行资质审核、培训与考核。收集、统计眼科互联网护理咨询门诊接诊量、患者满意度、首诊问题分类及护士职业获益感等数据。结果：2021年6月26日至12月31日累计接诊患者1266人次;接诊时间主要在08:00—22:00;咨询次数最多的问题种类是眼健康知识科普;患者对眼科互联网护理咨询门诊的总体满意度为99.52%;眼科互联网护理咨询门诊运营后,眼科护士职业获益感总分及各维度得分均有提高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论：眼科互联网护理咨询门诊服务可有效满足各类人群的眼健康护理需求,患者满意度高,亦可提高眼科护理人员的职业获益感,值得进一步推广。