纳豆激酶基因重组质粒在大肠杆菌与毕赤酵母中的稳定性

利用PCR方法以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因片段,分别克隆到原核表达载体pBV220与真核表达截体pPICZaA上,转化大肠杆菌HB101与毕赤酵母GS115,筛选重组子,通过限制性内切酶,PCR分析及序列测定,测定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,对重组大肠杆菌与毕赤酵母中外源基因的稳定性进行研究比较,结果表明外源基因的插入对宿主菌的生长没有太大影响,重组质粒在E.coli HB101中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差,而外源基因在毕赤酵母（GS115中很稳定。     

血管紧张素Ⅱ与肥胖性高血压的关系

在许多发达国家中,约75%～80%的高血压患者不同程度肥胖,65%～75%的原发性高血压患者同时并有肥胖。当体质量指数>25 kg/m~2时,心血管疾病的发生率和死亡率随之增高,在原发性高血压发生中,肥胖也是一个主要的危险因素,研究证实,体质量每增加4.5 kg,患者的收缩压会增加4 mmHg。同时减肥能有效改善高血压。目前研究发现,肥胖性高血压可能与血容量和心排量增多,胰岛素抵抗,肾素血管紧     

血管紧张素Ⅱ与肥胖性高血压的关系

在许多发达国家中,约75%～80%的高血压患者不同程度肥胖,65%～75%的原发性高血压患者同时并有肥胖.当体质量指数>25 kg/m2 时,心血管疾病的发生率和死亡率随之增高,在原发性高血压发生中,肥胖也是一个主要的危险因素,研究证实,体质量每增加4.5kg,患者的收缩压会增加4 mmHg[1-].同时减肥能有效改善高血压.     

RNA干扰血管紧张素原基因表达对前脂肪细胞3T3-L1分化的影响

目的:构建靶向血管紧张素原(AGT)基因的RNA干扰质粒,研究AGT基因对鼠前脂肪3T3-L1分化的影响。方法:设计靶向AGT的小分子RNA干扰片段(AGT-shRNA),以未靶向任何DNA的小分子RNA(Non-shRNA)为对照,利用载体psiRNA-U6.1/Neo构建重组表达质粒,转染鼠前脂肪细胞3T3-L1并筛选到稳定转染细胞株,RT-PCR和SDS-PAGE法分别检测AGT基因沉默效果,通过显微镜观察和脂肪细胞分化标志物检测来确定AGT基因干扰对3T3-L1细胞分化的影响。结果:成功构建AGT干扰质粒,与对照组比较,AGT基因转录水平受到显著抑制(P<0.05),AGT蛋白表达水平也仅为对照的43.86%。AGT基因干扰后3T3-L1细胞脂质水平和甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)活性仍随分化时间延长呈上升趋势,但增长量明显低于对照组(P<0.05)。结论:RNA干扰AGT基因可明显抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,提示脂肪组织中的肾素-血管紧张素系统(RAS)与脂肪代谢有重要关联。     

A、C、Y、W135四群脑膜炎球菌发酵罐培养工艺的研究

目的利用40L发酵罐分别培养四群流行性脑膜炎奈瑟球菌（简称脑膜炎球菌）A、C、Y和W135;优化和比较四种菌的发酵工艺,为开发四价脑膜炎疫苗提供工艺技术。方法通过培养基组成、发酵时间、发酵中补料的形式和补料量,以及搅拌速度、接种密度等培养动力学的研究,比较四种菌培养特性的相同和差异。结果四群流脑球菌的培养特性基本相同,达到最高培养密度的时间及菌体收获率分别为,A和Y群在接种后11 h,收获率均为40%;C群在10 h,收获率30%;W135群在9 h收获率为25%。每种菌对于营养的要求基本相同但在发酵动力学上的差异使补料有所区别。结论发酵罐中采用完全培养基培养,并设定良好的培养条件,及时补充碳源,有利于脑膜炎球菌生长,提高了四价脑膜炎疫苗的产量和质量。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用ＰＣＲ方法以分泌纳豆激酶的纳豆杆菌染色体ＤＮＡ为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到质粒载体ＰＵＣ１９上,筛选重组子,通过限制性内切酶和ＰＣＲ技术分析初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,凝块溶解时间法（ＣＬＴ）测出表达产物具有溶解血栓性。在确定了最佳培养时间与诱导时间后,ＳＤＳＰＡＧＥ分析结果表明基因表达产物为分泌     

干扰素β1a基因真核表达质粒的构建和表达

目的：构建干扰素β1a(IFN-β1a)的CHO表达体系，探讨人IFN-β1a在真核细胞中的表达效果。方法：采用全基因合成法获取重组人IFN-β1a基因，并通过点突变将IFN-β1a的17位半胱氨酸进行修饰，合成的基因经PCR扩增，连接入 pSV2-dhfr 质粒中，构建重组真核表达质粒 pSV2-dhfr-IFN-β1a。将质粒转染至 CHO-dhfr－细胞中，经 MTX 加压筛选，获得稳定生长的能够持续表达IFN-β1a的单克隆细胞株；提取细胞基因组DNA，进行PCR 鉴定。收集细胞培养上清液，采用 Wish 细胞病变抑制法检测转染细胞中 IFN-β1a的抗病毒活性。结果：重组真核表达质粒 pSV2-dhfr -IFN-β1a 经 PCR 及双酶切鉴定证明构建正确；以转染细胞基因组 DNA 为模板，可扩增出 IFN-β1a 基因；转染后重组细胞表达的 IFN-β1a具有抗病毒活性，达到3×105 IU·mL^－1。结论：IFN-β1a基因真核表达质粒构建成功，并在 CHO 细胞中成功表达了具有较高生物学活性的 IFN-β1a 蛋白。     

血管紧张素Ⅱ对前脂肪细胞分化相关转录因子表达的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)对前脂肪细胞分化过程中转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP1-c/ADD-1表达的调节从而研究AngⅡ调节前脂肪细胞分化可能的分子机制。方法 3T3-L1前脂肪细胞体外传代培养及诱导分化,用RT-PCR技术检测诱导分化过程中不同浓度AngⅡ处理6d对前脂肪细胞分化相关转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP1-c/ADD-1 mRNA表达水平的影响。结果 RT-PCR结果显示,100 nmol/L的AngⅡ处理细胞6 d后,PPARγ、C/EBPα、SREBP1-c/ADD-1 mRNA的相对表达量与对照组(AngⅡ添加浓度为0 nmol/L)有显著性差异(P<0.05),比对照组相应的转录因子分别增加了48%、50%、43%。结论前脂肪细胞分化过程中AngII能够上调PPARγ、C/EBPα、SREBP1-c/ADD-1 mRNA的表达量,AngⅡ可能通过影响PPARγ、C/EBPα和SREBP1-c/ADD-1的表达来调节前脂肪细胞的分化过程。