人BTLA-Fc融合蛋白的制备及其生物学活性的研究

为建立CHO/BTLA-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌BTLA-Fc融合蛋白,采用PCR法从本单位构建的pEGZ-Term/B7-H1-Fc重组质粒中扩增人IgG1(Fc)恒定区,Xho I、BamH I双酶切后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接为重组质粒pIRES2-EGFP-Fc,同时PCR法从pEGZ-Term/BTLA重组质粒中获得人BTLA胞外段基因片段,用Nhe I、Xho I双酶切插入上述pIRES2-EGFP-Fc构建重组载体pIRES2-EGFP/BTLA-Fc。脂质体法以该重组载体转染鼠CHO细胞,G418筛选并亚克隆化。Protein G亲和层析柱对上清中的融合蛋白进行纯化,Western blot作定性分析。CCK-8检测BTLA-Fc融合蛋白对抗人CD3单抗激发的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染CHO细胞培养上清中表达的BTLA-Fc融合蛋白能与L929/HVEM细胞有效结合,纯化的融合蛋白经Western blot鉴定有清晰的目的条带,而且BTLA-Fc融合蛋白对T细胞的体外增殖具有抑制作用。     

两种白细胞滤器获取单个核细胞作为实验研究的生物学功能的比较*

目的：分析单采血小板去白细胞滤器(apheresis platelet leukoreduction system chambers, LRSCs)和全血去白细胞滤器(whole blood leukoreduction filters, LRFs)所收集的白细胞替代常规人全血白细胞进行实验的相关生物学功能和表型。方法：分别采用直接法和反冲洗获得LRSCs和LRFs白细胞，经人的淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。用CD3激发型抗体和细胞因子白细胞介素2(interleukin, IL-2)体外扩增培养10 d，观察细胞形态、细胞增殖、细胞凋亡，并用流式细胞术(flow cytometry, FCM)进行表型分析，对比两种滤器分离出的白细胞生物学差异。结果：(1)PBMCs镜下观察：LRSCs中细胞较纯，个体大小较均一；LRFs包含部分形态较小的血小板和形态较大的粒细胞。两者细胞活力无差异。(2)LRSCs所分离的PBMCs细胞亚群以淋巴细胞为主，单核细胞次之，含极少量的粒细胞；而LRFs淋巴细胞与粒细胞比例接近，单核细胞较少。初始状态淋巴细胞群体中各细胞亚群表型相似。(3)LRSCs-PBMCs细胞，经CD3与IL-2体外刺激后，细胞活化集落大且较均一，而LRFs-PBMCs细胞集落多但分布较散。(4)体外培养第6天、第10天两组滤器间淋巴细胞各亚群表型差异无统计学意义。(5)两种滤器血PBMCs细胞凋亡率类似，且均为早期凋亡细胞比例高于晚期凋亡细胞。(6)经体外扩增培养10 d，发现两种滤器血PBMCs细胞增殖速率相当，细胞活力等同。结论：两种滤器所得的白细胞均可用于相关的基础实验研究，且LRFs含有较多的粒细胞，这也为粒细胞的研究工作提供了便利，解决了临床用血与实验用血的需求。     

人膜型LIGHT分子对Mo-DC成熟和T细胞激活的调节作用

利用我们建立的表达人膜型LIGHT分子的基因转染细胞(L929/LIGHT)探讨LIGHT/HVEM信号体外对Mo-DC诱导分化的影响,并进一步研究其对T细胞活化和抗凋亡的共刺激作用。从健康人外周血中分离的单核细胞经GM-CSF联合IL-4诱导形成Mo-DC,流式细胞术分析Mo-DC诱导过程中HVEM和LIGHT的表达;基因转染细胞L929/mock、L929/LIGHT、L929/CD40L或L929/LIGHT联合L929/CD40L,分别经丝裂霉素处理后,与GM-CSF联合IL-4诱导的Mo-DC共育,流式细胞术检测Mo-DC细胞表面成熟标志CD83和CD86的表达,利用FITC-Dextran分析Mo-DC对抗原的摄取能力;L929/LIGHT或L929/mock经丝裂霉素处理后,与抗人CD3单抗激发的T细胞共育,流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞表面活化标志CD25的表达,Annexin V和PI双标记分析T细胞的凋亡率。结果表明,高表达HVEM的单核细胞在诱导形成成熟Mo-D(iDC)的过程中下调了HVEM的表达,成熟Mo-DC(mDC)又上调表达HVEM,而LIGHT在Mo-DC分化过程中呈短暂的诱导性表达;基因转染细胞L929/LIGHT及其联合L929/CD40L能上调Mo-DC表面共刺激分子CD83和CD86的表达,并下调Mo-DC对FITC-Dextran的摄取能力;L929/LIGHT细胞能上调CD4+、CD8+T细胞CD25的表达,并增强T细胞抗凋亡能力。因此,基因转染细胞L929/LIGHT表面表达的人膜型LIGHT分子介导的LIGHT/HVEM共刺激信号对Mo-DC的诱导成熟和T细胞活化及抗凋亡能力具有促进作用。     

丁酸钠联合Feed促进293F细胞表达PD-1嵌合抗体

目的: 探讨丁酸钠和CHO CD Efficient Feed(以下简称Feed)对293F细胞表达程序性死亡受体 1（PD 1）嵌合抗体产量的影响。方法: 采用无血清培养基,通过哺乳动物293F细胞瞬时表达抗人PD 1嵌合抗体;在细胞对数生长期添加不同浓度丁酸钠(0,0.5,1,2,4 mmol／L)处理293F细胞,连续培养7 d,分别在第1,3,5天添加Feed。同时,每24 h对培养细胞进行取样,自动细胞计数仪检测细胞总量和活性,流式细胞术检测细胞周期。结果： 丁酸钠联合Feed可有效提高293F细胞表达PD 1嵌合抗体,最高表达量为57.4 mg／L,是对照组产量的近8倍;丁酸钠可抑制细胞过度增殖,并阻滞细胞周期G1期,同时添加Feed可增加抗体产量。 结论： 丁酸钠控制293F细胞适度增殖,Feed则有利于提高细胞活力,两者作为细胞培养的有效补充剂可显著提高PD 1嵌合抗体的产量。     

不同加热时间的食用油对雄性小鼠血脂与微量元素的影响

[目的]探究不同加热时间的食用油对雄性小鼠血脂与微量元素的影响。[方法]40只雄性昆明小鼠分为5组,每组8只。对照组采用蒸馏水灌胃,4个实验组分别采用未加热、加热1 h、加热3 h、加热9 h的食用油灌胃,每日灌胃量0.015 mL/g。使用试纸检测各食用油的酸价及过氧化值。6周后,摘眼球取血,分离血清,采用酶标法检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)浓度;原子吸收分光光度法检测铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)质量浓度。[结果]食用油的酸价及过氧化值均随加热时间延长而增加(r=0.991,r=0.972;均P0.05)。摄入不同加热时间的食用油之后,各组间小鼠血清LDL浓度、Cr质量浓度、LDL/HDL值差异存在统计学意义(均P0.05);与未加热组相比较,9 h组小鼠血清LDL浓度增加,LDL/HDL值升高,Cr质量浓度减少,差异具有统计学意义(均P0.05);TC、TG、HDL、Mn、Fe各组间差异无统计学意义(均P0.05)。[结论]食用油加热时间达到9 h时,可使小鼠血清LDL浓度、LDL/HDL值增加,Cr浓度减少。     

人LIGHT基因转染细胞株的建立及其对T细胞协同刺激作用的研究

建立人协同刺激分子LIGHT的基因转染细胞株,探讨其体外对T细胞活化与增殖的协同刺激作用。采用RT-PCR法从活化的人外周血T细胞中克隆人LIGHT编码区全长基因,经EcoR I和BamH I双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体构建成pIRES2-EGFP-LIGHT重组子,脂质体法以重组质粒pIRES2-EGFP-LIGHT转染鼠L929细胞。经G418长期加压筛选,免疫荧光标记和流式细胞术分析LIGHT分子在基因转染的L929细胞膜上的表达,MTT法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)探讨获得的基因转染细胞L929/LIGHT体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测转基因L929/LIGHT细胞膜上能稳定高表达人LIGHT分子。体外细胞共培养试验表明,与未转染LIGHT基因的L929/mock细胞相比,L929/LIGHT能显著地促进抗人CD3单抗(mAb)刺激的T细胞增殖;同时L929/LIGHT亦能明显促进T细胞对IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌。建立了稳定高表达人LIGHT分子的基因转染细胞株,LIGHT介导的信号在体外对T细胞增殖和相关细胞因子的分泌具有显著地促进作用。