中国7个地区诺如病毒G II．4／Sydney 2012变异株分析

目的　分析2012--2013年冬季中国地区诺如病毒新流行株GII．4／Sydney 2012的衣壳蛋白区核苷酸与氨基酸变异特点。方法　对已获得的22份2012--2013年冬季北京地区GⅡ．4／Sydney2012株进行全衣壳蛋白区基因扩增。从GenBank检索中国其他地区的GⅡ．4／Sydney 2012株衣壳蛋白区核苷酸序列。对获得的GII．4／Sydney 2012株的衣壳蛋白区核苷酸及氨基酸序列与往年GⅡ．4流行株进行系谱分析。结果　获得中国7个地区（北京、上海、江苏、湖州、荆州、香港和台湾）的GⅡ．4／Sydney 2012株资料共38份（至少包含完整VPl核苷酸序列）。GH．4／Sydney 2012株之间VPl核苷酸差异为0．1％～3．3％,氨基酸差异为0～3．1％。系谱分析发现GⅡ．4／Sydney2012株与Apeldoorn 2008和NewOrleans 2009起自共同的分支。中国和悉尼GH．4／Sydney 2012代表株的A、D、E抗原表位氨基酸序列组合有两种：TSRN-GTT-SNT和TSRN-STT-SNT。结论　G II．4／Sydney 2012株已在中国多个地区出现,各地区病毒株同源性较高。G H．4／Sydney 2012株的抗原表位氨基酸组合发生明显改变。     

树突细胞的成熟状态和慢性病毒性肝炎

树突细胞(dendritic cells，DC)是体内最强的提呈细胞，能诱导T细胞定向分化为Th1或Th2，在其成熟过程中伴随着表面分子的种类和数量，细胞功能及迁移能力等方面的变化而变化，并受多种因素的调节。本文就此及DC在慢性病毒性肝炎发生和临床上的作用进行综述。     

乙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2.2.15细胞中的亚细胞定位及转移

目的观察HepG2．2．15细胞内HBV核心蛋白的亚细胞定位及转移，了解核心蛋白的入核机制。方法2％二甲亚砜或（和）1μmol／LBay414109处理HepG2．2．15细胞4d；荧光共聚焦显微镜观察HBsAg和HBcAg在细胞内的定位；Westernblot检测胞质和胞核中的HBcAg水平；选择性PCR检测胞核内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）水平。结果二甲亚砜处理提高了胞质和胞核内的HBcAg表达及核内的cccDNA水平；Bay414109处理后胞质中HBcAg水平下降但胞核中HBcAg水平上升，cccDNA水平下降；联合应用二甲亚砜和Bay41—4109处理后HBsAg在胞质内呈条索状分布，胞质中HBcAg水平下降，但胞核内HBcAg明显上升，cccDNA水平下降。结论HepG2．2．15细胞中存在HBV核心颗粒入核障碍，游离核心蛋白易于通过核孔，二甲亚砜可促进核心蛋白进入细胞核，并有助于cccDNA的形成。     

PTD-HBcAg体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用

目的 观察融合蛋白PTD-HBcAg诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟及对T淋巴细胞增殖的作用.方法 体外分离培养近交系BALB/C小鼠髓源性DC加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rgM-CSF)、重组IL-4培养5 d,再加人TNF-a、HBcAg和PTD-HBcAg诱导DC成熟.激光共聚焦显微镜观察免疫荧光在细胞中的分布及定位,流式细胞计数仪测定DC表面分子表达,ELISA法测定DC培养上清液中IL-12 p70的水平,CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应.组间数据比较采用t检验.结果 成功体外诱导培养小鼠髓源性DC,HBcAg主要定位于DC膜表面,而PTD-HBcAg能够穿透DC膜进入细胞质.PTD-HBcAg能明显上调DC表面分子CD80、CD86和主要组织相容性复合体(MHC)II类分子表达;50 mg/L和100 mg/L PTD-HBcAg诱导DC分泌IL-12 p70水半分别为(142.50±18.31)ng/L和(124.30±15.12)ng/L,明显高于HBcAg诱导组的(42.31±4.21)ng/L(t=9.234和9.045,均P＜0.05);PTD-HBcAg诱导DC刺激T淋巴细胞增殖能力明显高于HBcAg组及阳性对照TNF-a组.结论 PTD-HBcAg具有穿透DC膜能力,并能促进DC分化、成熟,明显上调表面共刺激分子表达,增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及分泌IL-12 p70的水平.     

DMSO促进HepG2细胞感染乙型肝炎病毒后核心蛋白入核

目的:探讨DMSO诱导处理的HepG2细胞被HBV感染的作用机制.方法:将HepG2分为DMSO处理组和对照组,分别用添加或不添加2%DMSO的DMEM培养基培养4 d.将HBV病毒颗粒(1000拷贝/细胞)加入培养基中于37℃感染12h.以蛋白免疫印迹,免疫荧光染色及共聚焦显微镜观察HBcAg在细胞内的定位.选择性PCR检测HBV cccDNA,流式细胞分析仪检测细胞周期.结果:对照组HepG2细胞在感染HBV阳性血清后,HBcAg在细胞质内分布,核内呈阴性,至感染后2 d细胞内核心蛋白消失,未检出明显的cccDNA信号.2%DMSO处理后的HepG2细胞感染后12 h细胞质内HBcAg水平明显高于对照组,感染后24 h HBcAg在核周浓集.在感染后24 h和48 h核内HBcAg明显增高,且cccDNA结果阳性.流式分析结果显示DMSO处理后处于G_1/G_0和G_2/M期的HepG2比例升高,处于有丝分裂期的HepG2细胞内HBcAg弥散分布于全细胞.结论:HepG2细胞感染HBV后核心颗粒不能穿过核孔携带HBV DNA进入细胞核可能是其抵制HBV感染的重要原因.DMSO可促进HBV核心颗粒进入细胞核而有助于感染.     

转录反式激活蛋白转导域介导HBcAg穿透细胞膜的作用

目的 观察蛋白转导域(PTD)-HBcAg融合蛋白的细胞膜穿透作用.方法 合成转录反式激活蛋白(Tat)-PTD编码序列,PCR技术扩增HBcAg全长基因,通过重叠延伸PCR片段拼接法将Tat-PTD编码序列和HBcAg全长基因融合,将融合基因克隆到pMAL-c2X原核表达载体中.挑选测序正确的构建质粒,转化大肠埃希菌Rosetta-gamiTM2(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达,Western印迹鉴定,亲和层析纯化融合蛋白PTD-HBcAg,同样方法得到HBcAg蛋白作为对照.纯化蛋白加入细胞培养介质中,间接免疫荧光检测进入细胞内的PTD-HBcAg和HBcAg.结果 大肠埃希菌中过度表达的融合蛋白可通过亲和层析纯化,Western印迹证实纯化的PTD- HBcAg和HBcAg能被HBeAg单克隆抗体识别,细胞免疫荧光检测证实PTD-HBcAg可跨膜转导入细胞内,而单独的HBcAg未能在细胞内检测到.结论 融合蛋白PTD-HBcAg可在原核表达系统中高效表达、分离纯化,PTD能介导HBcAg穿透细胞膜进入细胞.     

黄芪多糖对小鼠树突状细胞分化及成熟的影响

目的探讨黄芪多糖(APS)是否具有诱导小鼠髓源性树突状细胞(DC)分化和成熟的作用,以阐释APS药理作用的机制。方法APS分别取25(APS25组)、50(APS50组)、75(APS75组)、100 mg／L(APS100组)4种浓度,分别体外诱导小鼠髓源性DC前体和未成熟DC,采用倒置显微镜观察细胞生长状态,电子显微镜检测细胞形态,流式细胞仪检测CD11C、主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子及协同刺激分子CD80、CD86表达水平。结果APS、APS 白介素(IL)-4及空白对照组诱导的DC前体细胞,培养结束时大部分细胞已经死亡。粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-csF) IL-4诱导小鼠髓源性DC,在APS刺激36 h后,流式细胞检测结果显示APS100、APS75、APS50组的CD80、CD86、CD11c、MHC-Ⅱ类分子表达水平均明显高于空白对照组(P值均< 0．05),与内毒素(LPS)组类似;空白对照组与APS25组的差异无显著性(P>0．05)。结论APS不能诱导小鼠髓源性DC前体分化为DC,但可能有促进DC成熟的作用。     

磷酸脂酶抑制剂冈田酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

 目的 初步鉴定可能与 HBV 核心蛋白去磷酸化有关的磷酸酯酶。 方法 以磷酸酯酶 2A 抑制剂冈田酸（OA）处理体外培养的人肝癌 HepG2.2.15 细胞。将细胞分为 4 组，分别加入终浓度为 0（对照组）、10、20、30 ng/ml 的 OA（OA 10 ng 组、OA 20 ng 组、OA 30 ng 组），每组各设 5 孔。在培养 0、2、4、6 d 时分别收集各组细胞培养上清液，采用电化学发光方法检测 HBsAg 浓度，荧光实时定量 PCR 方法检测 HBV DNA 拷贝数。取培养 2 d 时的各组细胞，采用蛋白质印迹方法检测 HBcAg 异质性，免疫荧光细胞化学染色方法检测 HBcAg 亚细胞定位。 结果 OA 10ng 组、OA 20 ng 组各时间点细胞培养上清液HBsAg 浓度、HBV DNA 拷贝数分别与对照组相应各时间点比较，差异均无统计学意义；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带、亚细胞定位分别与对照组比较均无明显异常。OA 30 ng 组在培养 2、4、6 d 时细胞培养上清液 HBsAg 浓度（ng/ml）均明显低于对照组相应各时间点（分别为 385.9 ± 43.1 vs. 510.2 ± 63.3、346.5 ± 39.6 vs. 484.6 ± 59.4、295.1 ± 32.8 vs. 467.2 ± 52.9，P 值分别为 0.028、0.022、0.016）；在培养 2 d 时细胞培养上清液 HBV DNA 拷贝数（ml-1）明显高于对照组相应时间点（6.71 ± 6.07 vs. 6.34 ± 5.72，P = 0.022），而在培养 4、6 d 时均明显低于对照组相应各时间点（分别为 5.80 ± 5.19 vs. 6.29 ± 5.68、4.75 ± 4.15 vs. 6.25 ± 5.58，P 值分别为 0.008 和 0.005）；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带明显增宽，约 20% 的 HepG2.2.15 细胞的细胞核内 HBcAg 红色荧光信号明显增强。 结论 短时间、高浓度的 OA 处理可提高 HBV DNA 的复制水平和核心蛋白的磷酸化水平，提示磷酸酯酶 2A 可能参与了 HBV 核心蛋白的去磷酸化过程。     

细胞人基因组DNA对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA的影响

 目的 研究细胞人基因组 DNA 对荧光实时定量 PCR（FQ-PCR）检测细胞培养上清液中 HBV DNA 含量的可能干扰影响，提高细胞培养上清液中 HBV DNA 定量检测的准确性。方法 取 HBV DNA 阳性血清，以 DMEM 培养基分别配制出 HBV DNA 拷贝数为 5 × 107/ml（高拷贝组）、5 × 105/ml（中拷贝组）、5 × 103/ml（低拷贝组）的不同样本组；各组内再分 5 个亚组，分别加入终浓度为 0（对照组）、12.5、25、50、100 μg/ml 的细胞人基因组 DNA（提取自人肝癌细胞系 HepG2）。以不含 HBV DNA 阳性血清的 DMEM培养基加入上述浓度细胞人基因组 DNA 为空白组。采用基于 TaqMan 技术的 FQ-PCR 检测各组样本的 HBV DNA 拷贝数并绘制 HBV DNA 定量曲线。每组均重复检测 10 次。根据 HBV DNA 定量检测结果确定受干扰样本和未受干扰样本，分别计算其定量曲线线性期斜率和平均扩增效率。 结果 高拷贝组中加入不同浓度细胞人基因组 DNA 的各个亚组与相应对照组比较，HBV DNA 拷贝数差异均无统计学意义。中拷贝组中加入细胞人基因组 DNA 浓度为 50 和 100 μg/ml 的 2 个亚组，其 HBV DNA 拷贝数结果明显高于相应对照组，增高可达 50 ~ 100 倍，且重复性差。低拷贝组中只有加入细胞人基因组 DNA 浓度为 12.5 μg/ml的亚组可通过提高基线值取得与相应对照组接近的定量检测结果，而其他亚组 HBV DNA 定量曲线指数扩增期斜率明显异常，无法确定其定量检测结果。空白组各亚组均未观察到明显的 HBV DNA 指数扩增期。受干扰样本线性期斜率（-1.01 ± 0.06）和平均扩增效率（90.0% ± 2.1%）与对照组样本（分别为 -1.52 ± 0.06，97.0% ± 0.4%）比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 细胞人基因组 DNA 对应用 FQ-PCR 技术进行的HBV DNA 定量检测可产生非特异性干扰，尤其在 HBV DNA 拷贝水平较低时。在细胞培养上清液作 HBV DNA 定量检测时应尽量去除细胞人基因组 DNA。     

树突细胞的成熟状态和慢性病毒性肝炎

树突细胞 (dendriticcells,DC)是体内最强的提呈细胞 ,能诱导T细胞定向分化为Th1或Th2 ,在其成熟过程中伴随着表面分子的种类和数量 ,细胞功能及迁移能力等方面的变化而变化 ,并受多种因素的调节。本文就此及DC在慢性病毒性肝炎发生和临床上的作用进行综述。