Survivin特异性siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的研究

目的 观察survivin特异性siRNA对胰腺癌细胞株Panc-1细胞增殖和凋亡的影响.方法 体外构建Survivin特异性siRNA表达载体p-Survivin-siRNA,转染胰腺癌细胞株Panc-1细胞系,RT-PCR和Western印迹法检验其对胰腺癌细胞株Panc-1细胞的RNA干扰(RNAi)效果.采用MTT法分析其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.同时,采用Western印迹法检测半胱氨蛋白酶 3(caspase 3)的表达变化.结果 p-survivin-siRNA表达质粒高效而特异地剔降胰腺癌细胞株Panc-1细胞中survivin的表达,抑制肿瘤细胞增殖(P<0.01),阻断胰腺癌细胞株Panc-1细胞在G1期.随着survivin基因被沉默,caspase 3表达升高(P<0.01).结论 靶向survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制胰腺癌细胞株Panc-1细胞增殖,促进细胞凋亡.     

Survivin在顺铂诱导Panc-1细胞凋亡中的作用

的 :体外观察顺铂是否具有诱导胰腺癌细胞株 (Panc-1)凋亡的作用 ,同时观察在此过程中凋亡抑制蛋白 Survivin的表达变化 ,为探讨胰腺癌的化疗耐药机制提供理论基础。方法 :用人 Panc-1株进行培养传代 ;MTT试验检测顺铂以不同浓度和不同时间对 Panc-1株生长的抑制作用 ;用 RT-PCR检测凋亡过程中 Survivin基因表达的动态变化。结果 :顺铂可明显抑制 Panc-1细胞增殖 ,其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性 ;DNA电泳可以观察到凋亡的发生 ,而且呈药物浓度、作用时间依赖关系 ;Survivin表达水平随着顺铂作用浓度的增加而下降 ,当顺铂浓度为 5 0μg/ml时下降最明显 (61% ) ;Survivin c DNA/β-actin c DNA比值与细胞增殖抑制率和细胞凋亡率呈负相关 (P<0 .0 1)。结论 :顺铂可以有效诱导 Panc-1株的细胞凋亡 ,而且 Survivin基因的抑制在顺铂诱导 Panc-1株的细胞凋亡中起重要作用。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

创伤早期患者外周血树突状细胞的变化及临床意义

目的　探讨创伤后早期患者外周血树突状细胞 (DC)变化及临床意义。方法　分离创伤患者 ( 2 7例 ,创伤组 )和健康人 ( 12例 ,对照组 )外周树突状细胞 ;通过流式细胞仪检测各组的DC数量 (CMRF 44标记法 )及DC表面HLA DR、CD80、CD86表达水平以及DC诱导的T细胞反应性增殖。检测各组外周血上清中白细胞介素 6(IL 6)、IL 10的浓度。结果　创伤组DC细胞数( 7.9± 3 .2 )× 10 6/L明显低于对照组DC ( 14 .9± 5 .1)× 10 6/L(P <0 .0 1)。创伤组DC表面HLA DR及CD80、CD86的表达水平与对照组相比明显下调 (P <0 .0 1)。DC诱导的T细胞增殖能力对照组明显强于创伤组 (P <0 .0 1)。在创伤组中血清IL 6、IL 10的浓度 ( 2 .42± 0 .3 3 ) μg/L和( 1.49± 0 .2 7) μg/L显著升高 ,与对照组比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。 结论　创伤早期患者外周血DC数量少 ,功能低下 ,与创伤后的免疫功能低下关系密切。     

CTLA4Ig修饰的树突状细胞在体外对淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的:探讨CTLA4Ig修饰的树突状细胞(DC)对T细胞增殖和细胞毒性T细胞(CTL)细胞毒活性的影响。方法:采用脂质体转染法,将质粒pG/CTLA4Ig转入DC。采用ELISA和SDS-PAGE鉴定转染质粒pG/CTLA4Ig的DC培养上清。以C57BL/6小鼠的单个核细胞作为反应细胞,以未修饰的DC及修饰的DC作为刺激细胞,共培养6 d,用MTT比色法检测细胞的增殖。用乳酸脱氢酶法和ELISA法,分别测定细胞毒活性及T细胞凋亡。结果:CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对同种细胞刺激的增殖反应有明显地抑制作用;而未修饰的DC可显著诱导淋巴细胞增殖反应。CTLA4Ig融合蛋白和修饰的DC,对特异性CTL的细胞毒活性有明显地抑制作用,且可诱导T细胞凋亡。结论:稳定表达CTLA4Ig融合蛋白的DC,对T细胞增殖和对CTL的细胞毒活性具有明显地抑制作用,并可诱导T细胞凋亡。     

消退素RvE1对日本血吸虫病所致肝损伤的保护作用

目的 通过检测日本血吸虫病肝损伤模型小鼠肝功能指标及有关细胞因子的表达水平,研究消退素RyE1对小鼠日本血吸虫病肝损伤的保护作用及其机制.方法 30只昆明小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、治疗组(RvE1)共3组,每组10只,用日本血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染小鼠,构建日本血吸虫病肝损伤模型.感染5周后,模型对照组小鼠每天每只单次尾静脉注射N.S.,治疗组小鼠每天每只单次尾静脉注射100 ng RyE1,上述各组均连续给药至感染第10周末.感染10周后,观察其肝脏组织形态,测定肝脏系数,ELISA检测血清丙氨酸氨基转氨酶(ala-nine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性;采用Real-Time PCR或Western Blot检测TNF-α mRNA和蛋白的表达变化.结果 感染10周后,模型组中小鼠的肝脏系数、血清ALT和AST活性分别为(84.9±10.3) mg/g, (331.60±49.21) U/L, (368.74±72.76) U/L,与模型对照组比较,RvE1治疗组对小鼠肝损伤有明显的修复作用,能降低日本血吸虫病所致肝损伤小鼠的肝脏系数(68.6±5.1)、血清ALT (97.82±21.66) U/L和AST (156.19±38.81) U/L活性,两者差异有统计学意义(P＜0.01);RyE1治疗组小鼠肝组织中促炎介质TNF-α的mRNA和蛋白表达较模型对照组有明显降低.结论 给予外源性RvE1可以通过抗炎作用,有较好的保肝作用,拮抗日本血吸虫病所致肝损伤.     

多元化考核方式在病原生物学与免疫学综合实验考核中的应用

目的培养学生自主学习性,增强学生实际动手操作能力。方法在病原生物学与免疫学实验整合的基础上,建立了包括实验技能操作、实验报告评估、设计性实验、标本考试及实验理论考试等在内的多元化考核方式。结果实践成功证明了其可行性,取得了预期成效。结论多元化考核方式的建立对培养具有创新精神和创新能力的高素质人才、提高课程教学质量具有极其重要的作用。     

β-半乳糖苷结合凝集素-9真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β-半乳糖苷结合凝集素-9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明β-半乳糖苷结合凝集素-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体pGal-9。     

CTLA4-Ig在树突状细胞中的表达及效应研究

目的 获得CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,分析表达产物CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响。方法 采用脂质体转染方法将CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,通过ELISA法鉴定转染DC细胞48和72h培养上清液及稳定表达的培养上清液,分离Balb/c小鼠和C57BL/10J小鼠淋巴细胞为反应细胞和刺激细胞,观察CTLA4-Ig对同种细胞混合培养反应的影响。结果 将鼠CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,获得瞬时表达及稳定表达,CTLA4-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应,且效应亦呈剂量依赖性。结论 鼠CTLA4-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,其抑制作用随表达载体转染细胞培养上清液的增加而增强。同时获得了稳定表达CTLA4-Ig融合蛋白的CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,为以后的工作奠定了基础。     

CTLA4Ig修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的：探讨CTLA4Ig修饰的DC对实验动物免疫功能的影响。方法：将经CTLA4Ig基因修饰或未修饰Dc腹腔注射C57BL／6致敏小鼠，以致敏或未致敏C57BL／6单个核细胞作为反应细胞，以未修饰DC细胞及修饰DC为刺激细胞，共培养6天，采用MTT比色法检测细胞增殖，乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性。结果：CTLA4Ig融合蛋白对未修饰DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应有明显的抑制作用。CTLA4Ig修饰DC诱导不同组小鼠淋巴细胞增殖反应均明显降低，CTLA4Ig融合蛋白对CTL细胞毒活性有显著抑制作用。CTLA4Ig修饰DC对不同组小鼠CTL细胞毒活性均具有抵抗作用，未修饰DC细胞对未致敏小鼠以及未修饰DC对致敏小鼠CTL细胞毒活性敏感。结论：稳定表达CTLA4Ig融合蛋白的DC诱导显著降低同种小鼠淋巴细胞的增殖反应和对CTL细胞毒活性的抵抗。