人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的竞争性逆转录-聚合酶链反应定量分析

为建立人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达检测方法,研究载脂蛋白E基因与儿童健康的关系,我们抽取26例健康儿童外周静脉血,分离血单核细胞,抽提RNA,采用逆转录-聚合酶链式反应检测载脂蛋白E基因表达,并以正常人cDNA作定量标准物,待测样品与定量标准物共扩增,计算出待测样本的个体的mRNA量.研究发现载脂蛋白E基因能在健康儿童周围血单核细胞表达,健康儿童载脂蛋白E基因表达量为0.37±0.15 mol/mol mRNA.表明采用竞争性逆转录-聚合酶链反应方法来检测人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的分析方法快速、简便、灵敏、实用、可靠,且能准确定量,值得推广应用.     

单纯性肥胖儿童脂肪细胞载脂蛋白E基因的表达

以RT PCR法分析脂肪细胞载脂蛋白E(apoE)基因的表达,发现肥胖儿童脂肪细胞apoE基因表达水平显著下调,重度及中心性肥胖尤甚,提示apoE基因可能与肥胖密切相关。     

组织型纤溶酶原激活因子构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性

背景：组织型纤溶酶原激活因子被认为是血管系统内初期血栓清除的关键酶。目的：构建pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞，观察外源性组织型纤溶酶原激活因子的表达情况。设计：随机对照实验。单位：中南大学湘雅二医院及中国医学遗传学国家重点实验室。材料：实验于2002-09／2003-06在中国医学遗传学国家重点实验室完成。脐静脉内皮细胞取自中南大学湘雅二医院健康产妇分娩后胎盘脐带，pcDNA3．1为Smith Kline Beecham公司赠送。方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子，并将pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子转入人脐静脉内皮细胞，用酶联免疫吸附法定量检测转基因后组织型纤溶酶原激活因子蛋白表达情况、发色底物法检测外源性组织型纤溶酶原激活因子活性。以转pcD-NA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞为观察对象，未转pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞作为对照。主要观察指标：组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量及活性测定结果。结果：①组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量表达结果为568．6ng／10。细胞／24h，未转pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为17．8ng／10。细胞／24h。②组织型纤溶酶原激活因子活性为108．8IU／10。细胞／24h，未转pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为5．6IU／105细胞／24h。结论：pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子转染人脐静脉内皮细胞后，外源性组织型纤溶酶原激活因子基因获有效表达。为pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子转入人体细胞确立了有效依据。     

pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性研究

目的建立TPA基因在人脐静脉内皮细胞外源性表达的方法，为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄提供理论依据和新方法。方法构建真核表达载体pcDNA3．1( )TPA，并采用脂质体法将其转入体外培养的人脐静脉内皮细胞，并现察外源性TPA表达情况。结果真核表达载体pcDNA3．1( )TPA在人脐静脉内皮细胞中获有效表达，酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为568．6ng／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为17．8ng/10^6细胞／24h；发色底物法测得外源性TPA活性为108．8IU／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为5．6IU／10^6细胞／24h。结论pcD．NA3．1( )TPA转入人脐静脉内皮细胞后，外源性TPA基因荻有效表达，为缺血性心脏病的TPA基因治疗提供了理论依据和新方法。     

冠心病患者外周血单核细胞载脂蛋白E基因表达的研究

本研究旨在探讨人外周血单核细胞载脂蛋白E(apolipoprotein ,apoE)表达状况及与冠心病 (coronaryheartdisease ,CHD)的相关性。一、对象与方法研究对象来源于海南省人民医院及中南大学湘雅二医院 ,有确诊的CHD史者列为研究组 ,年龄、性别与研究组基本近似的无CHD病史健康成人为对照组。各收集 2 3例 ,男17例 ,女 6例 ,年龄 4 0～ 70岁。禁食 12h ,抽取外周静脉血10ml,肝素抗凝。采用竞争性逆转录 聚合酶链式反应方法检测apoE基因表达 ,并检测血脂水平。应用SPSS10 0统计软件包进行统计分析 ,组间比较采用t检验或方差分析 ,并行相关…     

组织型纤溶酶原激活因子构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性

背景组织型纤溶酶原激活因子被认为是血管系统内初期血栓清除的关键酶.目的构建pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞,观察外源性组织型纤溶酶原激活因子的表达情况.设计随机对照实验.单位中南大学湘雅二医院及中国医学遗传学国家重点实验室.材料实验于2002-09/2003-06在中国医学遗传学国家重点实验室完成.脐静脉内皮细胞取自中南大学湘雅二医院健康产妇分娩后胎盘脐带,pcDNA3.1为SmithKline Beecham公司赠送.方法构建真核表达载体pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子,并将pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子转入人脐静脉内皮细胞,用酶联免疫吸附法定量检测转基因后组织型纤溶酶原激活因子蛋白表达情况、发色底物法检测外源性组织型纤溶酶原激活因子活性.以转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞为观察对象,未转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞作为对照.主要观察指标组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量及活性测定结果.结果①组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量表达结果为568.6 ng/106细胞/24 h,未转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为17.8 ng/106细胞/24 h.②组织型纤溶酶原激活因子活性为108.8 IU/106细胞/24 h,未转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为5.6IU/106细胞/24 h.结论pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子转染人脐静脉内皮细胞后,外源性组织型纤溶酶原激活因子基因获有效表达,为pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子转入人体细胞确立了有效依据.     

TPA基因克隆与体外表达模型建立

目的 重组TPA基因并构建体外表达模型，为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄奠定基础。方法 构建真核表达载体pcDNA3．1( )TPA，然后将pcDNA3．1( )TPA转入中国苍鼠卵巢(CHO)细胞，并观察外源性TPA表达情况。结果 真核表达载体pcDNA3．1( )TPA在CHO细胞表达量好，发色底物法测得外源性TPA活性为12．296IU／10^6细胞／24hr，未转pcDNA3．1( )TPA的CHO细胞测得为3．176IU／10^6细胞／24hr；酶联免疫实验(ELASA)检测结果为586．172ng／10^6细胞／24hr，未转pcDNA3．1( )TPA的CHO细胞测得为9．608ng／10^6细胞／24hr，达未转TPA基因组的60倍。结论 pcDNA3．1( )TPA转入CHO细胞后，外源性TPA基因获有效表达，为TPA临床基因治疗提供了理论依据。     

pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人皮肤成纤维细胞的表达活性

为建立TPA基因治疗缺血性心脏疾病及防止血管再狭窄的新方法。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA ,并采用脂质体法将其转入体外培养的人皮肤成纤维细胞 ,并观察外源性TPA表达情况。结果发现 :真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达 ,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为 6 4 7.8ng/(10 6细胞·2 4h) ,未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为 19.2ng/ (10 6细胞·2 4h) ;发色底物法测得外源性TPA活性为 12 5.0U/ (10 6细胞·2 4h) ,未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为 5.8U/ (10 6细胞·2 4h)。提示 :pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后 ,外源性TPA基因获有效表达 ,为TPA基因治疗缺血性心脏病的临床研究提供了前提基础     

健康儿童载脂蛋白E基因表达的研究

目的探讨健康儿童外周血单核细胞载脂蛋白E基因表达及其与载脂蛋白E基因型之间的关系.方法采用竞争性逆转录-聚合酶链反应方法分析46例正常健康儿童外周血单核细胞的载脂蛋白E基因表达,采用改良的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测载脂蛋白E基因型.结果载脂蛋白E基因能在健康儿童外周血单核细胞表达,健康儿童载脂蛋白E基因表达量为(0.47±0.15)moles/mole GAPDH mRNA,载脂蛋白E基因表达量没有明显的性别差异(P＞0.05).健康儿童载脂蛋白E基因型分布不均,E 3/3(32例),E 2/3(8例)及E4/3(6例),未见E 2/2、E 2/4、E4/4.载脂蛋白ε2、ε3、ε4等位基因的频率分别是0.09、0.85、0.06.与ε3等位基因携带者比较,ε 2等位基因携带者载脂蛋白E基因表达量上调,ε4等位基因携带者的载脂蛋白E基因表达量下调[分别为(0.47±0.12)moles/mole GAPDH mRNA、(0.42±0.10)moles/mole GAPDH mRNA、(0.28±0.09)moles/mole GAPDHmRNA,P均＜0.05].结论载脂蛋白E基因能在健康儿童周围血单核细胞表达,载脂蛋白E基因多态性影响健康儿童外周血单核细胞载脂蛋白E基因表达水平.