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目的 为胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝(NAFLD)发病与甘油-3-磷酸酰基转移酶-4(GPAT4)后续相关研究提供肝脏GPAT4基因敲除小鼠模型。方法 选择C57BL/J6雌性与雄性小鼠各10只及白蛋白启动子调控的Cre转基因(Alb-Cre)小鼠作为研究对象。采用Cre/LoxP基因打靶策略,构建基因打靶载体,引入LoxP位点,获得基因同源重组胚胎干细胞(ES);将ES植入小鼠,分别获得嵌合鼠、杂合子、纯合子小鼠。最终获得肝脏特异性GPAT4敲除小鼠。基因分型实验对第8外显子下游的loxP位点设计基因型鉴定引物,以便进行批量快速基因型分析;随机抽取3只小鼠进行解剖,从高表达GPAT4的小鼠肝脏、白色脂肪和棕色脂肪提取总RNA,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测组织中GPAT4 mRNA表达;在小鼠的肝脏组织中提取总蛋白,使用蛋白质印迹法检测肝脏GPAT4表达,进一步验证肝脏GPAT4的敲除效果。结果 成功组装靶向载体,且GPAT4基因位于小鼠第8号染色体;酶切分析结果显示,6条带为线性后的靶标载体,线性载体在电泳中相对分子质量最大、速度最慢;导入ES后,确认了6个潜在... 相似文献
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