周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建

【提要】 提取周期型马来丝虫总RNA。跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白（BmPmy）基因序列，设计合成引物，并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点，应用RT?鄄PCR技术，扩增BmPmy基因片段，克隆至载体pGEM?鄄T中，经PCR和双酶切鉴定后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1（+），成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（+）-BmPmy，并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析。转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA，结果与预期相符。     

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物, 以马来丝虫mRNA为模板, RT-PCR扩增BmG3PD基因, 将其克隆入pGEM-T载体, 转化大肠埃希菌（E. coli）DH5α, 筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定, 获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD, 经序列分析及同源性比较, 以及对其编码产物进行B细胞表位预测, 结果表明PCR扩增的特异性条带为1 020 bp, 与预期相符, 与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测, 氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。     

周期型马来丝虫CPI基因克隆和序列分析及编码产物B细胞表位预测

目的 克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因,并通过序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测,为进一步研究该基因的功能奠定基础.方法 从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增BmCPI基因,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-TBmCPI,经测序验证,并进行同源性比较.应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测.结果 RTPCR扩增出一条约621 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.其编码产物经表位预测分析,B细胞表位可能在23～32、50～79、117～126位氨基酸区域.结论 成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组质粒pGEM-T克隆载体,并进行了序列测定及编码产物的B细胞表位预测,达到预期目标,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

马来丝虫肌球蛋白基因序列及编码产物预测

目的 克隆周期型马来丝虫肌球蛋白(BmMyosin)基因,进行序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测.方法 依据公布的BmMyosin基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的 编码基因.扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E. coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmMyosin,经测序验证,并进行同源性比较.应用5种参数和方法 对其编码产物进行B细胞表位预测.结果 RT-PCR扩增出一条约1 292 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果 与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为98.45%.经表位预测分析,BmMyosin的B细胞表位可能在287～300位、339～350位和416～422位氨基酸区域.结论 成功构建了周期型马来丝虫肌球蛋白重组质粒pGEM-T克隆载体,对其编码产物进行B细胞表位预测.为蛋白质特性分析及免疫学研究提供基础依据.     

周期型马来丝虫副肌球蛋白基因克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

目的：克隆周期型马来丝虫副肌球蛋白（BmPmy）基因，进行序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测。方法：从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA，以mRNA为模板，RT-PCR法体外扩增BmPmy基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆人pGEM—T载体，转化E．coliDH5a，筛选阳性克隆，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒pGEM—TBmPmy，经测序验证，并进行同源性比较。应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测。结果：RT-PCR扩增出一条约2640bp的特异性条带，重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符，DNA序列分析与基因库已知的基因序列同源性为99％。经表位预测分析，BmPmy的B细胞表位可能在54～66位、144～152位、770～780位和834～845位氨基酸区域。结论：成功构建了BmPmy重组质粒pGEM—T克隆载体，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的克隆与真核表达

目的 克隆和表达周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)的编码基因.方法 依据公布的BmGAPDH基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克隆后,克隆至载体pGEM-T Easy中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对获得重组蛋白(rBmGAPDH)进行分析和鉴定.结果 转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的 基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的结果 一致.SDS-PAGE分析显示重组蛋白rBmGAPDH相对分子质量(Mr)约为43 000.结论 成功进行了BmGAPDH编码基因的克降和真核表达.Cloning,weukaryotic expremion of the gene encoding glyceraidehydes-3-phosphate dehydrogenase from periodic Brugia malayi XIE Dong-fimg,FANG Zheng,HUANG Wei-qun,SHEN Qin,TONG Hai-yan,XUBang-sheng.     

恶性肿瘤误诊2例分析

恶性肿瘤一般早期症状多不明显 ,若缺乏充分认识 ,细致检查及认真鉴别 ,易造成误诊 ,而使患者错过最佳手术时机。1　临床资料例 1、胆管癌误诊为黄疸型病毒性肝炎 :刘某 ,男 ,38岁 ,农民 ,1999年 2月 2 1日就诊。因间断性肩背部隐痛伴乏力 1年余 ,进行性黄疸伴恶心、呕吐 2个月入院。 1年前出现间断性肩背部隐痛 ,乏力 ,食欲不振 ,2个月前出现皮肤巩膜黄染 ,进行性加重 ,无发热 ,进食后出现恶心、呕吐、小便如浓茶 ,大便陶土色。在当地门诊按“急性黄疸型病毒性肝炎”治疗 ,上述症状逐渐加重 ,2 0天前出现皮肤瘙痒。病后体重明显减轻。家族…     

年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响

背景：人骨髓间充质干细胞的增殖和分化可以修复组织器官损伤，随着年龄增长人体组织修复能力减弱，是否人骨髓间充质干细胞增殖能力随年龄增长而减弱尚不清楚。 目的：观察年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响。 方法：15份骨髓标本来源于青岛市中心医院骨折或行髋关节置换患者，其中儿童、成年人、老年人各5例，年龄分别为7~12岁，20~55岁，60~90岁。抽取人骨髓组织，采用密度梯度离心法分离出单核细胞并接种于培养瓶内，在第5天计数集落形成单位；当贴壁细胞融合后进行传代，第1代细胞分两种方式进行培养：192个细胞接种于2个96孔板观察单细胞克隆形成能力，12 500个细胞以5×103/cm2接种于培养瓶内并以此密度连续传代观察细胞增殖率。 结果与结论：不同年龄人群骨髓间充质干细胞体外培养集落形成单位和细胞增殖率无明显区别(P > 0.05)，但单细胞克隆形成能力随年龄增长而下降(P < 0.01)。提示骨髓间充质干细胞的数量和增殖能力没有随年龄的增长而下降，但其中能形成单细胞克隆未定向干细胞的数量随年龄的增长而减少。     

年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响

背景：人骨髓间充质干细胞的增殖和分化可以修复组织器官损伤,随着年龄增长人体组织修复能力减弱,是否人骨髓间充质干细胞增殖能力随年龄增长而减弱尚不清楚。目的：观察年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响。方法：15份骨髓标本来源于青岛市中心医院骨折或行髋关节置换患者,其中儿童、成年人、老年人各5例,年龄分别为7～12岁,20～55岁,60～90岁。抽取人骨髓组织,采用密度梯度离心法分离出单核细胞并接种于培养瓶内,在第5天计数集落形成单位;当贴壁细胞融合后进行传代,第1代细胞分两种方式进行培养：192个细胞接种于2个96孔板观察单细胞克隆形成能力,12500个细胞以5×103/cm2接种于培养瓶内并以此密度连续传代观察细胞增殖率。结果与结论：不同年龄人群骨髓间充质干细胞体外培养集落形成单位和细胞增殖率无明显区别（P〉0.05）,但单细胞克隆形成能力随年龄增长而下降（P〈0.01）。提示骨髓间充质干细胞的数量和增殖能力没有随年龄的增长而下降,但其中能形成单细胞克隆未定向干细胞的数量随年龄的增长而减少。