NRP1基因敲除对放射性肺纤维化进程的影响及其作用机制

目的：观察神经菌毛蛋白1（NRP1）基因对放射性肺纤维化（RIPF）进程的影响,并探讨其在Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路和转化生长因子β1（TGF-β1）/Smads通路介导的上皮间质转化（EMT）发生发展过程和细胞外基质（ECM）沉积中的作用。方法：利用Cre-LoxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ）特异性敲除NRP1基因的转基因C57BL/6J小鼠并进行鼠尾鉴定,将160只小鼠按照射后不同时间点随机分为4周组、8周组、16周组和24周组,每组小鼠按随机数字表法分为野生型（Con）组、野生型单纯照射（IR）组、NRP1基因特异性敲除（KO-Con）组和NRP1基因特异性敲除+照射（KO+IR）组,每亚组10只。KO-Con和KO+IR组小鼠腹腔注射他莫昔芬特异性敲除AT-Ⅱ细胞NRP1基因,IR组和KO+IR组小鼠采用20 Gy全胸照射建立RIPF小鼠模型。模型构建完成后,利用HE染色法和Masson染色法验证模型是否构建成功;利用免疫组织化学（IHC）法检测小鼠肺组织中Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达水平;Western blotting法检测小鼠肺组织中NRP1、β-catenin、TGF-β1和Smad2蛋白表达水平;实时荧光定量-聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测小鼠肺组织中NRP1、Col Ⅰ、α-SMA、β-catenin、TGF-β1、Smad2、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）mRNA表达水平。结果：HE染色和Masson染色显示RIPF小鼠模型构建成功,IR组小鼠肺部主要为放射性肺炎病理形态表现。与Con组比较,随时间的延长,IR组小鼠肺组织中NRP1蛋白和mRNA表达水平逐渐升高（P<0.05）,24周时达到最高（P<0.01）。与Con组比较,随时间的延长IR组和KO+IR组小鼠肺组织中Col Ⅰ、α-SMA、β-catenin、TGF-β1和Smad2蛋白及mRNA表达水平逐渐升高（P<0.05或P<0.01）;与IR组比较,随时间的延长,KO+IR组小鼠肺组织中Col Ⅰ、α-SMA、β-catenin、TGF-β1和Smad2蛋白和mRNA表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）,但仍高于Con组（P<0.05或P<0.01）。与Con组比较,随时间的延长,IR组和KO+IR组小鼠肺组织中上皮细胞标志物E-Cadherin mRNA表达水平逐渐降低（P<0.05）,间质细胞标志物N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01）,但KO+IR组小鼠肺组织中E-CadherinmRNA表达水平明显高于IR组（P<0.05或P<0.01）,N-Cadherin和Vimentin mRNA表达水平均明显低于IR组（P<0.05或P<0.01）。结论：NRP1基因敲除可抑制RIPF的发生发展,其机制可能与调节小鼠肺组织中Wnt/β-catenin和TGF-β1/Smads信号通路的表达进而抑制EMT进程有关。     

Treg分化对放射性肺损伤的影响

目的 探讨调节性T细胞（Treg）的分化对放射性肺损伤的影响及其作用机制。 方法 建立Treg抑制小鼠模型,按随机数字表法将C57BL/6小鼠分成4组:空白对照组、单纯照射组、照射+免疫球蛋白G（IgG）组和照射+CD25组,每组12只,除空白对照组外其余3组小鼠给予单次20 Gy X射线全胸照射,照射+IgG组和照射+CD25组小鼠每周腹腔注射IgG抗体和CD25抗体。分别于照射后第4周和第8周各处死小鼠6只,采用流式细胞术检测小鼠肺组织内CD25+Foxp3+Treg（Foxp3:叉头样转录因子3）的百分比以鉴定模型是否建立成功;采用Western blot法检测单纯照射组小鼠肺组织内神经纤毛蛋白1（NRP1）的表达;采用免疫荧光法检测每组小鼠肺组织内CD25+NRP1+Treg的百分比;拍照并观察每组小鼠皮肤的损伤情况,采用苏木精-伊红染色法检测小鼠肺组织的病理学改变;采用酶联免疫吸附测定法检测每组小鼠肺组织内转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素（IL）-17A、干扰素γ（IFN-γ）、IL-2和IL-4的水平变化。两组间比较采用独立样本t检验。 结果 流式细胞术检测结果显示,照射后第4周和第8周,单纯照射组小鼠肺组织内CD25+Foxp3+Treg百分比[（1.73±0.04）%、（2.13±0.15）%]均较空白对照组[（1.14±0.02）%、（1.70±0.06）%] 明显升高,差异均有统计学意义（t=?26.680、?4.545,P=0.000、0.010）,抑制Treg后,第4周和第8周时照射+CD25组小鼠肺组织内CD25+Foxp3+Treg百分比[（0.72±0.14）%、（0.27±0.02）%]均较单纯照射组明显降低,差异均有统计学意义（t=5.296、37.538,均P=0.000）。Western blot结果显示,照射后第4周和第8周,单纯照射组小鼠肺组织内NRP1蛋白表达水平均较空白对照组升高,差异均有统计学意义（t=?7.341、?9.127,均P=0.000）。免疫荧光法检测结果显示,照射后第4周和第8周,单纯照射组小鼠肺组织内CD25+NRP1+Treg的百分比均较空白对照组升高,而照射+CD25组CD25+NRP1+Treg百分比均较单纯照射组降低,且差异均有统计学意义（t=8.926、14.457,P=0.001、0.000）。观察小鼠皮肤损伤程度后发现,照射后第4周和第8周,单纯照射组小鼠皮肤损伤严重,而照射+CD25组小鼠照射后第4周时皮肤基本完好,第8周时出现脱毛脱皮。病理学结果显示,照射后第4周和第8周,与空白对照组相比,单纯照射组小鼠的肺组织结构破坏,肺泡壁增厚,细胞外基质增多,而照射+CD25组小鼠的肺组织结构完整,肺泡壁纤细。酶联免疫吸附测定结果显示,与空白对照组相比,照射后第4周,单纯照射组小鼠肺组织内IL-17A和IL-4的水平均升高,差异均有统计学意义（t=?8.492、?15.796,P=0.001、0.000）,照射后第8周,TGF-β1和IL-17A水平升高,差异均有统计学意义（t=?11.072、?7.167,P=0.000、0.002）,IL-2水平在第4周和第8周时均降低,IFN-γ水平在第4周时升高,差异有统计学意义（t=?27.393,P=0.000）,第8周时下降;与单纯照射组相比,照射+CD25组小鼠TGF-β1和IL-17A水平在第4周和第8周时均降低（t=6.037、4.524、5.496、4.772,均P=0.000）,IFN-γ水平升高（t=?7.006、?12.565,P=0.002、0.000）,差异均有统计学意义,而IL-2和IL-4水平在第4周时均降低,第8周时均明显升高,差异均有统计学意义（t=2.866、?9.090、8.833、?7.191,均P=0.000）。 结论 放射性肺损伤小鼠的肺组织中出现Treg分化,并增强分泌TGF-β1促炎因子,同时干扰辅助T细胞（Th1、Th2型）细胞因子的平衡来促进放射性肺损伤的发生。     

神经纤毛蛋白1在辐射诱导肺上皮细胞转化中的调控作用

目的 通过利用神经纤毛蛋白1（NRP1）不同表达水平的肺上皮细胞模型，检测电离辐射诱导上皮-间充质转化（EMT）标志物及相关转录因子表达变化，探讨NRP1对辐射诱导肺上皮细胞EMT发生中的作用。方法 对人肺Ⅱ型上皮细胞（A549）构建NRP1过表达（NRP1^high-A549）和NRP1敲低（NRP1^low-A549）细胞模型，同时对小鼠正常肺上皮细胞（MLE-12）构建siNRP1-MLE-12细胞模型并进行验证。对NRP1^high-A549、NRP1^low-A549和siNRP1-MLE-12细胞模型分别进行单次10 Gy X射线照射，于照射后0、12、24和48 h提取总蛋白和总RNA。利用Western blot法和q-PCR法检测各组细胞模型中EMT标志物（β-catenin、N-cadherin和Vimentin）及相关转录因子（Twist和ZEB1）的变化。结果 野生型A549和MLE-12细胞照射后NRP1 mRNA和蛋白表达显著升高，间充质标志物（Vimentin和N-cadherin）显著升高（A549：t=2.917、7.361，P<0.01；MLE-12：t=9.652、31.357，P<0.01），ZEB1和Twist转录因子表达显著升高（A549：t=4.852、9.278，P<0.01；MLE-12：t=30.985、17.266，P<0.01）。NRP1^low-A549和siNRP1-MLE-12组受照后Vimentin和N-cadherin表达显著下降（NRP1^low-A549：t=10.077、15.707，P<0.01；siNRP1-MLE-12：t=5.745，P<0.01），上皮标志物（β-catenin）蛋白表达显著升高；而NRP1^high-A549组照射后N-cadherin和Vimentin显著升高（t=16.055、5.560，P<0.01），而β-catenin显著下降。检测NRP1^low-A549组Twist转录因子在照射后显著下降（t=3.987，P<0.01），而NRP1^high-A549组ZEB1和Twist转录因子照射后呈时间依赖性升高（t=11.289、2.903，P<0.01）；siNRP1-MLE-12细胞模型照射后ZEB1转录因子显著下降（t=13.449，P<0.01），siNRP1-MLE-12组ZEB1和Twist蛋白表达均低于对照组，呈时间依赖性下降。结论 NRP1可促进辐射诱导人和小鼠上皮细胞的EMT发生，而这种促进作用可能通过上调转录因子ZEB1和Twist的表达。     

低剂量辐射生物效应的研究进展

低剂量辐射(low-dose radiation,LDR)生物效应仍然是放射生物学领域的研究热点.随着研究的深入,对LDR产生的各种生物效应及其机制不断完善.越来越多的证据表明,LDR诱导的生物效应和高剂量辐射不同,这些研究对"线性无阈"模型提出质疑.本文从LDR诱导的旁效应、兴奋效应、适应性反应以及低剂量辐射超敏感性...     

RNA的m6A修饰在恶性肿瘤及其放疗中作用机制的研究进展

N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine,m⁶A)是哺乳动物中最丰富的RNA碱基修饰,尤其是在真核信使RNA(mRNA)中。m6A修饰可调节RNA的剪接,易位和稳定性,进而影响蛋白质的合成。m6A修饰被RNA甲基转移酶(writers)催化;通过去甲基酶(erasers)还原;还可以被甲基化识别酶(readers)识别。基因的m6A水平异常变化与肿瘤的发生和发展密切相关,即包括增殖、生长、侵袭和转移等。在肿瘤的放射治疗过程中,m6A修饰通过影响DNA损伤、肿瘤干细胞生成、以及肿瘤细胞辐射敏感性等,进而影响放疗疗效。本文就RNA的m6A修饰的表观遗传调控在恶性肿瘤中的作用以及在肿瘤放疗中作用机制的研究进展进行了综述,旨在为临床肿瘤分子靶向疗法和放射增敏剂的研发提供新的思路。     

环状RNA作为肿瘤标志物及其在肿瘤放疗中应用的研究进展

放疗是肿瘤综合治疗的重要手段之一,但放疗抵抗是影响肿瘤患者放疗疗效及预后的一大难题。由于肿瘤细胞放疗抵抗的机制十分复杂,所以至今还未找到特别有效的调控放疗敏感性的开关分子。环状RNA（circRNA）是一类通过反式剪接使得 3' 末端与 5' 末端共价结合的闭合circRNA分子,具有丰度高、结构稳定和特异性强等特征。circRNA参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程,可以作为新型肿瘤分子标志物和潜在的治疗靶点。此外,circRNA在受照后的肿瘤细胞中存在差异性表达,并可作为微小RNA（miRNA）的海绵,调控与肿瘤放疗抵抗相关的miRNA及其下游信号通路,使其有望成为攻克肿瘤放疗抵抗的突破口。笔者综述了circRNA作为新型肿瘤标志物及其在肿瘤放疗中应用的研究进展。     

Hippo信号通路的调控机制及其在肿瘤细胞辐射效应中作用的研究进展

Hippo信号通路是以激酶级联反应为核心的进化保守的信号通路,在调控哺乳动物的器官大小、组织稳态、组织再生、伤口愈合和肿瘤发生中起着关键作用。Hippo信号通路受到细胞密度变化、外部机械压力和（或）其他内在和外在信号的刺激,使核心复合物控制转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）和转录共激活因子 PDZ 结合基序蛋白移位到细胞核内,从而调控各种生物学效应。另外,YAP作为Hippo信号通路的主要效应分子,在许多肿瘤中异常表达,与肿瘤的发生和发展密切相关,包括肿瘤细胞增殖及凋亡、肿瘤转移和耐药等。Hippo信号通路对肿瘤细胞辐射效应的影响主要体现在YAP对肿瘤细胞辐射敏感性和辐射抗性的影响上。笔者就调控Hippo信号通路的分子类型、Hippo信号通路对肿瘤的调控作用及其对肿瘤细胞辐射效应的影响进行了综述,旨在为肿瘤治疗及放射增敏剂的研发提供新的思路。