幽门螺杆菌塑性区hp4565基因的克隆表达 及其功能初探

摘要:目的　为克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）临床株的塑性区hp4565基因,并制备抗体,以探讨其生物学功能。方法　以标准株NCTC shfi470的hp4565基因组全长设计引物,以H.pylori临床株为模板,PCR扩增临床株中hp4565基因,经原核表达后,选定最适条件大量诱导表达并经Ni2+-NTA柱纯化的目的蛋白。用MTT法检测重组蛋白对胃上皮细胞GES-1增殖影响,定磷法检测重组蛋白ATP酶活力。用纯化蛋白为抗原免疫家兔后制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果　成功克隆表达了hp4565基因,全长942 bp,编码313个氨基酸,原核表达后SDS-PAGE电泳显示有41 kDa的融合蛋白,Western blot鉴定是预期HP4565蛋白。纯化后获得较高纯度的重组蛋白,MTT法结果显示HP4565蛋白在低浓度（≤40 mg/L）时对细胞增殖无明显影响;蛋白浓度在60 mg/L以上时,细胞增殖随着培养时间的延长和浓度的增加呈现逐渐降低的趋势;重组蛋白具有一定的ATP酶活力,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶1.6×105。结论　成功克隆表达了H.pylori临床株塑性区hp4565基因,得到纯度较高的蛋白和滴度较高的抗体,重组蛋白对胃上皮细胞增殖有一定影响,并具有一定的ATP酶活力。     

2005—2010年北京市平谷区细菌性痢疾流行病学分析

目的分析2005—2010年北京市平谷区细菌性痢疾流行病学特征,为预防控制细菌性痢疾提供科学依据。方法采用描述流行病学分析方法对该区疫情网络直报资料进行分析。结果 6年中平谷区2010年细菌性痢疾发病率最高为119.25/10万,2008年最低为81.25/10万,细菌性痢疾发病有明显季节性,发病高峰为7—9月份;发病以山区和城区为主,城区发病逐年上升明显;3岁以下儿童和青壮年发病最多。结论平谷区菌痢发病率高,与人群卫生习惯、地区经济水平、饮食习惯、天气等均有关。养成良好的个人卫生及饮食习惯,做好夏秋季疫情控制,在5月份前做好防控准备,定期进行宣传,能有效控制细菌性痢疾发病和传播。     

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6 的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因
装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染
Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫
小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6 特异性抗体IgG 的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;
ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,
测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处
见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组
（空质粒组和生理盐水对照组）明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对
照组（空质粒组和生理盐水对照组）。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细
胞免疫和体液免疫效应。
     

结核病DNA疫苗研究进展

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mtb)引起的以呼吸道为主的一种传染性疾病,严重危害人类健康。随着医学科学技术的发展,人类对抗TB已取得了一定的成果,包括有效的治疗药物及疫苗的研发。但同时由于Mtb耐药的严重性、人类免疫缺陷性病毒( HIV)与Mtb的双重感染及流动人口的日益增多、吸毒等,加上不少国家对TB的忽视,TB在全球范围内呈回升趋势。世界卫生组织发布的《2012年全球结核病控制报告》[1]指出,虽然目前死于TB的人和患病的人都呈下降趋势,但每年仍有数百万TB新发病例,2011年全球新增TB患者870万人,死于TB的人数为140万人,其中新增TB患者中有3.7%患有耐多药TB,全球TB负担仍然十分严重。     

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组(空质粒组和生理盐水对照组)明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组(空质粒组和生理盐水对照组)。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。     

2004年榆林市直中小学生营养状况

目的 了解榆林市直中小学生现时营养状况。方法 采用身高标准体重法评价学生营养状况。结果 市直中小学校学生营养良好率为65．41％．营养不良率为26．14％，肥胖率为8．45％；其中营养不良者．农村学生高于城市学生．女生高于男生，中学生高于小学生；肥胖者．城市学生高于农村学生，男生高于女生．小学生高于中学生。结论 防治学生营养不良应以中学生特别是农村中学生为重点，防治肥胖应以小学生特别是城市小学生为主；在中小学校，开展平衡膳食、合理营养的健康教育活动．是改善中小学生营养现状的良策。     

解甘露醇罗尔斯顿菌致4例透析患者血流感染的临床特征及同源性分析

目的对解甘露醇罗尔斯顿菌所致血流感染的临床特征和医院内感染途径进行调査和分析,为临床预防和治疗提供依据。方法回顾性分析2017年10月5日-2018年1月14日医院4例解甘露醇罗尔斯顿菌所致血流感染患者的临床资料,共检出6株解甘露醇罗尔斯顿菌株,其中4株来源于血培养、2株来源于静脉留置导管尖端培养;对血液透析相关治疗用水及周围环境进行细菌培养、鉴定,并对分离到所有表型相似的同种细菌采用脉冲场凝胶电泳(FGE)进行同源性分析。结果所有患者均接受静脉导管置管并伴有≥3种基础疾病,发生血流感染时临床症状均为寒颤、发热;6株解甘露醇罗尔斯顿菌对头孢他啶、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星全部耐药,对头孢吡肟、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦全部敏感;同源性分析结果显示6株菌为同一克隆株;血液透析相关治疗用水及环境采样均未分离到该菌。结论本研究4例解甘露醇罗尔斯顿菌所致的血流感染为同一菌株克隆传播,尽管该菌所致血流感染来源尚不明确,但在血液透析病房存在该菌的克隆传播。     

结核分枝杆菌H37 Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。     

安徽省沿淮地区中华按蚊溴氰菊酯抗性及代谢解毒酶活性kdr突变频率调查

目的 了解安徽省沿淮地区疟疾媒介中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂的抗性状况及谷胱甘肽S转移酶 （GSTs）、 细胞色素氧化酶 （P450s） 等代谢解毒酶活性和钠离子通道击倒抗性基因 （Knockdown resistance, kdr） 的突变情况。方法 2011 年8-9月采集安徽省蚌埠市李楼乡、 沫河口镇和沱湖乡中华按蚊成蚊样本, 采用WHO成蚊接触筒药膜滤纸接触法, 调查3 个地区中华按蚊对溴氰菊酯抗性状况。随机挑选样本采用生化法检测代谢解毒酶活性并用PCR扩增产物直接测序法检测分析钠离子通道kdr基因IIS6片段L1014位点基因型。结果 李楼乡、 沫河口镇和沱湖乡3个检测点的中华按蚊对溴氰菊酯60 min内击倒率分别为4.1%、 7.0%和8.2%, 恢复24 h后校正死亡率分别为8.2%、 12.0%、 12.8%, 均为抗性种群。3个检测点的中华按蚊GSTs和P450s活性均显著高于实验室敏感种群 （P < 0.001）。3个检测点的中华按蚊kdr基因均发生突变, 存在 L1014C和L1014F两种突变类型, 无野生纯合型 （TTG/TTG）, 实验室敏感种群kdr基因均为无突变的野生纯合型。结论 安徽省沿淮地区的中华按蚊已对溴氰菊酯产生较强的抗性, 代谢解毒酶活性比实验室敏感种群显著升高, 钠离子通道kdr基因L1014位点出现高频率的突变。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。