抗人整合素β3亚基单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究

目的制备抗人整合素β3亚基的单克隆抗体(mAb),研究其对肿瘤治疗的作用。方法用RT-PCR方法扩增人β3胞膜外基因,将其克隆至原核表达载体pQE30中,获得含β3胞膜外基因的高效表达载体pQE30-β3,将其转化大肠杆菌M15,通过诱导表达及纯化,获得β3蛋白。将此蛋白免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗β3亚基mAb,Western blot鉴定mAb的特异性。通过小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验筛选出具有抑制肿瘤生长作用的mAb。进一步用MTT法及流式细胞术观察该mAb体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及诱导其凋亡的作用。结果扩增获得了β3胞膜外基因,构建了β3蛋白的原核表达载体,表达纯化了β3蛋白,成功制备了8株mAb,Western blot证明了其特异性。经过体内抑瘤实验筛选出一株具有显著抑制肿瘤生长的mAb4F12。该mAb可抑制HUVEC细胞增殖并诱导其凋亡。结论成功表达了β3蛋白,并制备了有活性的mAb,抗体具有抑制肿瘤生长的作用,这可能是通过抑制血管内皮细胞的增殖和诱发凋亡实现的。     

顾健人院士:德技双馨,誉耀杏林

顾健人院士是一位德技双馨、拥有真才实学的科学家,对国家、对医学科学均做出了重大贡献.他不是一般的科学家,而是一位战略科学家 [1].他既有中华民族的优秀传统美德,又具有现代改革开放创新意识.他惜才、爱才、护才、用才,他自己就是一位伯乐之才.顾健人院士在国际国内创造了多个"首创".他创建了癌基因与相关基因国家重点实验室;...     

五行汤抗肿瘤及经钙离子介导的促肿瘤细胞凋亡作用

目的:明确五行汤的抗肿瘤作用并初步探讨其机制.方法:不同浓度五行汤处理培养肿瘤细胞, MTT检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA变化;电镜观察细胞形态变化;特异性荧光探针检测胞浆钙离子浓度变化.结果:五行汤对多种肿瘤细胞生长有较特异的抑制作用;五行汤处理后的SGC-7901细胞经流式细胞仪检测出现亚二倍体峰,并呈时间-浓度依赖性;琼脂糖凝胶电泳呈现的DNA Ladder;电镜显示五行汤处理后的SGC-7901细胞呈现凋亡特征;Fluo-3 AM染色荧光显微镜观察到胞浆钙离子浓度升高;胞内钙离子拮抗剂Bapta AM可以明显降低五行汤处理后SGC-7901细胞的凋亡率,且对细胞的保护作用呈浓度依赖性.结论:五行汤有较明确的抑制肿瘤细胞生长作用,可能通过钙离子介导的肿瘤细胞凋亡发挥作用.     

肝癌抑制基因-1与转运功能相关的451 bp序列区的确定

背景与目的:肝癌抑制基因-1(HCCS1)是一种潜在的肝癌抑制基因,并且在细胞内蛋白分拣运输中也发挥着重要作用,其抑癌作用有可能是通过其蛋白转运的功能而发挥的,本文以寻找HCCS1序列中与转运相关的最小功能序列区域为目的.方法:通过亚克隆技术,构建以pEGFP-C2为载体的含不同长度HCCS1cDNA片段的亚克隆,将构建的亚克隆转染子宫颈癌HeLa细胞,通过免疫荧光共聚焦显微镜观察不同长度HCCS1蛋白的分布,以及与6-磷酸甘露糖受体(M6PR)的共定位.结果:成功构建了以pEGFP-C2为载体的10个含有不同长度HCCS1片段的亚克隆;HCCS1cDNA从3'端向5'端逐渐缺失的片段中:2 100 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈颗粒状分布于核周的胞质内,其中2 100 bp片段至1 571 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白均呈颗粒状、极性分布于核周的胞质内,且与M6PR有共定位;而1 120 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白虽然也呈颗粒状分布于核周,但极性分布消失,且与M6PR共定位消失;HCCS1cDNA片段678 bp片段至339 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈散点状弥散分布于胞质以及胞核内.结论:确定了HCCS1cDNA 1 571 bp片段的3'端451 bp的序列为与HCCS1转运功能相关的最小区域范围.     

肝癌抑制基因-1肿瘤靶向性表及其特异性抗肿瘤作用

目的 建立肝癌抑制基因-1(HCCS1)肿瘤靶向性表达载体,提高肿瘤治疗的安全性.方法 活细胞计数试剂盒测定HCCS1高表达对正常细胞和肿瘤细胞的影响,荧光素酶试验检测肿瘤特异性启动子PEG-3p在正常肝细胞和肝癌细胞中的相对转录活性,AdEasyTM系统包装并利用PCR鉴定重组腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1,Western blot检测重组腺病毒感染后HCCS1在正常细胞和肿瘤细胞中的表达情况,结晶紫试验和四甲基偶氮唑盐试验观察该重组腺病毒体外抗肿瘤的靶向性. 结果 HCCS1高表达对肿瘤细胞株BEL-7404和SW-620的生长抑制作用明显超过正常细胞株L02和正常人肺成纤维细胞,96 h抑制率达60%.荧光素酶试验显示,PEG-3p在BEL-7404、BEL-7405、QGY-7703中的相对转录活性分别为L02的3.9、4.7、1.5倍.成功构建了新抑癌基因HCCS1肿瘤靶向性表达的重组腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1,Western blot检测结果显示,在BEL7404和QGY-7703中,HCCS1表达高于在L02中的表达.结晶紫试验和四甲基偶氮唑盐试验显示,Ad-PEG-3p-HCCS1与Ad-CMV-HCCS1相比,在不降低对肿瘤抑制效果的前提下,明显降低了对正常细胞的杀伤作用. 结论 肿瘤细胞对HCCS1的生长抑制作用更为敏感,PEG-3p在肝癌细胞中也具有肿瘤特异性,Ad-PEG-3p-HCCS1可特异性地在肿瘤细胞中表达HCCS1,从而提高HCCS1基因治疗的安全性.     

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的：建立用多重逆转录聚合酶链反应（mRT-PCR）检测甲1型、甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道全胞病毒（RSV）A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法，以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况设计。方法：采用经MDCK细胞接种培养的甲3型、乙型流感病毒和Hep-2细胞接种培养的RSV A型、B型标准毒株病毒液，以及甲1型、甲3型、乙型流感病毒和RSV A型、B型混合毒株病毒液，使用5组引物，分别为HA1-5al和Hal-3al（甲1型流感病毒）、HA3-5al和HA3-3al和HA3-3al（甲3型流感病毒）、NP-5b1和NP-3bl（乙型流感病毒）、RSVAF和RSVAR(RSVA型)、RSVBF和RSVBR(RSVB型)，经mRT-PCR，琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果：甲1型、甲3型、乙型流感病毒，RSVA型、B型分别在431，210，390，334，183bp处出现清晰的5条DNA条带。结论：应用5组引物，mRT-PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV，并可对其进行分型，对上呼吸道病毒感染性疾病的诊断和流感的监测方面是非常重要的。     

五行汤经钙离子/溶酶体途径介导的SGC-7901细胞凋亡

目的 探索五行汤经钙离子/溶酶体途径介导的SGC-7901细胞凋亡机制.方法 吖啶橙染色检测溶酶体膜完整性,胞浆蛋白免疫印迹法检测凋亡途径蛋白变化,Annexin V结合实验和CCK-8法检测不同抑制剂对细胞凋亡和存活的影响.结果 凋亡细胞的溶酶体膜渗漏,溶酶休释放蛋白酶Cathepsin D和Cathepsin B至...     

甲3型、乙型流感病毒在MHL混合细胞中增殖的研究

[目的]建立MHL混合细胞瓶分离培养流感病毒的方法，为进行流感监测及临床快速诊断打下基础。[方法]采用MDCK、HEP—2、LLC混合细胞培养瓶和MDCK单一细胞培养瓶，同时分别接种甲3型和乙型流感病毒标准毒株，并设立阴性细胞对照组，观察甲3型和乙型流感病毒毒株在混合细胞瓶和MDCCK细胞瓶中的细胞病变效应(CPE)、血凝滴度和单克隆抗体荧光染色情况。[结果]病毒血凝滴度分别均为1：160，经1：5稀释的甲3型和乙型流感病毒接种MHL混合细胞瓶和MDCK细胞瓶经37℃、48h培养后，感染甲3型病毒细胞出现细胞拉网、团聚病变现象，感染乙型流感病毒细胞则出现明显细胞固缩、脱落现象，MDCK单一细胞培养瓶CPE强于混合细胞培养瓶：37℃、72h培养后，检测血凝滴度，感染甲3型流感病毒的MDCK细胞和混合细胞均为1：40。感染乙型流感病毒的MDCK细胞为1：120，MHL混合细胞为1：20；单克隆荧光抗体检测，感染甲3型和乙型流感病毒的MDCK细胞和混合细胞均呈阳性。[结论]应用MDCK、HEP—2，IL-2混合细胞瓶分离、培养，不仅可对甲型流感爆发进行流行病学监测，同时还可分离鉴定其它呼吸道病毒，利于临床诊断、治疗和预防。     

丰富生存环境对肿瘤的抑制作用及其相关基因通路分析

目的探讨丰富生存环境(EE)对肿瘤抑制作用及可能机制。方法 EE饲养环境为12只以上小鼠置大空间笼饲养,笼内设有用于小鼠探索、学习和运动的玩具。小鼠置EE环境饲养3周后,皮下接种B16F10恶性黑色素瘤细胞或Panc02胰腺癌细胞,置原环境继续饲养,比较EE组和常规环境(SE)饲养组小鼠的成瘤率和瘤重。APCMin/+基因突变小鼠3周龄起分别置EE和SE环境饲养,20周龄时处死小鼠,比较两组小鼠小肠腺瘤数量。实验还采用Agilent小鼠全基因组44K表达谱芯片对Panc02胰腺癌细胞移植瘤组织进行基因表达差异分析。结果与SE饲养比较,EE饲养对B16F10恶性黑色素瘤和Panc02胰腺癌皮下瘤的生长均有显著的抑制作用,抑瘤率分别为43.0%(P<0.05)和58.2%(P<0.01);EE对APCMin/+小鼠肠道腺瘤的生成也具有明显的抑制作用(P<0.05)。Panc02胰腺癌细胞移植瘤表达谱芯片结果的KEGG分析显示,有2倍以上表达差异的基因通路富集于细胞粘附和线粒体功能,并与神经退行性疾病和心脏疾病相关基因有交集。结论 EE对肿瘤的发生发展具有广泛的抑制作用,其对肿瘤细胞内线粒体功能的影响及其生物学意义值得深入研究。