特异性过敏原TBt多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备特异性苦荞主要过敏原TBt的多克隆抗体,为深入研究TBt分子中各结构域的功能奠定基础.方法:通过盐析,离子交换层析,分子筛层析等方法从苦荞种子中纯化出过敏蛋白TBt,免疫新西兰兔子,制备多克隆抗体.用间接ELISA、Western blot检测该抗体的效价和特异性；竞争ELISA研究IgG抗体对TBt过敏患者血清IgE的抑制作用.结果:间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶256000左右；Western blot显示该抗体能与TBt蛋白特异结合；竞争ELISA表明制备的IgG抗体能够特异性抑制养麦过敏患者血清1gE与过敏蛋白的结合.结论:制备的TBt多抗血清具有较高的效价和良好的特异性,该多克隆抗体可用于TBt的免疫活性鉴定,为下一步研究该蛋白的分子特征及免疫治疗奠定了基础.     

rBTI蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖、迁移及ROS产生的影响

目的:研究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移及胞内活性氧(ROS)的影响。方法:以不同浓度的rBTI蛋白(1.25 10μmol/L)作用肝癌HepG2细胞,通过MTT比色法检测rBTI蛋白对HepG2细胞增殖抑制作用;DAPI荧光染色法观察凋亡细胞的发生及形态学变化,流式细胞术(FCM)检测细胞内活性氧变化、划痕擦伤实验检测rBTI蛋白对HepG2细胞迁移的影响。结果:rBTI蛋白对HepG2细胞的生长具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖效应,但对正常细胞HL-7702影响很小;DAPI染色发现细胞产生凋亡小体;细胞内活性氧水平检测结果表明rBTI可以诱导HepG2细胞内ROS水平显著升高;划痕擦伤实验显示rBTI在一定浓度范围内可以抑制HepG2细胞迁移。结论:rBTI蛋白能够诱导HepG2细胞发生凋亡并抑制细胞增殖和迁移。     

苦荞过敏原TBa表位区段的表达及免疫活性分析

目的:确定苦荞过敏原(TBa)的主要表位区段。方法:以TBacDNA为模板,利用PCR方法,构建TBa的4个表位区段(E12、E3、E6、E36)的重组原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。经Ni2+-NTA亲和纯化后,SDS-PAGE分析。采用间接和竞争ELISA以及点杂交技术进行免疫活性测定。结果:获得了纯度较高的TBa重组表位蛋白(E12、E3、E6、E36),与先前获得表位E1、E2的免疫活性比较表明,重组表位蛋白与荞麦过敏症患者血清均有IgE结合活性,其中E1的活性最强。结论:E1可能是苦荞过敏蛋白TBa中最重要的抗原结合区域之一。     

苦荞蛋白复合物的营养成分及其抗衰老作用的研究

分析苦荞蛋白复合物的营养成分,观察其抗衰老效果。方法：用碱抽提和等电点沉淀法从苦荞麦籽粒中制备出苦荞蛋白复合物（ＴＢＰＣ）,再用含２０％ＴＢＰＣ饲料喂小鼠,观察对小鼠血液和脏器中超氧化物岐化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）和谷胱苷肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）的活性的影响。结果：ＴＢＰＣ的蛋白质含量为６３．４％,脂肪１２．７％,碳水化物１０．２％,灰分３．５％,粗纤维０．４％,水分９．８％。用ＴＢＰＣ饲喂后,小鼠血液、肝脏和心脏中ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性均有不同程度提高,脂质过氧化产物丙二醛（ＭＤＡ）含量下降。结论：苦荞蛋白复合物对生物体有一定营养和抗衰老作用。     

Cupin家族食物性过敏原表位研究进展

Cupin蛋白家族是一个具有多种功能蛋白的家族,它的进化可以追溯到从古细菌、细菌到真核生物.cupin来源于拉丁语" cupa",是指由至少6个β-折叠片形成的桶状结构[1].根据蛋白中含有cupin结构域的数目而把它们分类成不同的cupin亚群[2].具有两个cupin结构域的蛋白最初是在高等植物种子储藏蛋白中发现的.它们分为7S球蛋白三聚体(豌豆球蛋白)和11S球蛋白六聚体(豆球蛋白).7S和11S球蛋白大约有35％~45％的序列相似性,但是在结构上却具有高度的相似性[3].     

苦荞麦黄酮对人食管癌细胞EC9706增殖的影响

目的研究苦荞麦黄酮在体外对EC9706细胞增殖的影响。方法 MTT法观察苦荞麦黄酮对EC9706细胞的毒性,荧光染色法观察细胞核的改变,流式细胞术观察细胞周期和细胞内活性氧水平,Western blotting分析凋亡蛋白表达。结果苦荞麦黄酮明显抑制EC9706细胞的增殖,其抑制率与药物浓度和作用时间呈正相关。经DAPI染色,电镜观察细胞核,可见多个凋亡小体的形成。流式细胞仪检测发现,苦荞麦黄酮使细胞发生G2/M期周期停滞,细胞内活性氧水平明显增加,且呈浓度依赖效应。Western blotting分析表明,苦荞麦黄酮能上调细胞内的促凋亡蛋白Bax,并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量。结论苦荞麦黄酮对人食管癌细胞株EC9706增殖具有明显的抑制作用,使细胞发生周期阻滞,并能通过调节活性氧水平及改变凋亡蛋白的表达量诱导其发生凋亡。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明：重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞（PBMNC）无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52％;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论：重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。     

过敏蛋白TBb的免疫活性鉴定及其表位预测

目的 对重组的苦荞过敏蛋白TBb进行免疫学活性鉴定,并预测其B细胞表位.方法 根据已获得的苦荞过敏蛋白N端结构域TBb的基因序列,构建原核表达载体pET-32m-TBb,然后转入E.coli BL21(DE3)中表达,表达产物用Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化,并用ELISA分析其免疫学活性,综合分析TBb的二级结构、亲水性、可及性、可塑性、抗原性指数,并预测其B细胞表位的分布.结果 获得了纯度95%以上的重组过敏蛋白TBb,获得的重组蛋白能与养麦过敏病人血清中的IgE抗体特异性结合,具有较高的免疫学活性,在TBb蛋白的320个氨基酸残基中,预测到的B细胞表位位于6-17,31-45,50-57,88-94,103-134,138-146,156-163,178-185,192-220,240-260,267-299区段.结论 TBb蛋白的活性分析及B细胞表位的预测为进一步研究该蛋白的分子特征及应用奠定了基础.     

苦荞麦黄酮对人食管癌细胞 EC9706 增殖的影响

目的 利用理论对接方法研究黄芩中黄酮类化合物的潜在作用机制。方法 选取黄芩中 8 个黄酮类化合物 (包括苷元及其苷),收集现有靶标的晶体结构,利用 Schrodinger 软件进行计算,以分级标准评价选择性。结果文献报道黄芩黄酮类化合物药理作用共 26 种,其中与苷元及其苷类化合物对接结果相符的个数分别为9个和25个。表明苷元及其苷类化合物的靶标选择性与虚拟评价有差异,苷类化合物的结果与文献更接近。结论 说明虚拟评价技术对于中药复杂作用系统的研究具有较大的实用性,苷元与苷类化合物体内作用效果相似,而体内代谢是药物虚拟评价过程中非常重要的影响因素。     

苦荞叶提取物对小鼠体内抗氧化酶系的调节

以苦荞叶提取物为材料,通过灌胃观察小鼠血液及各脏器中的抗氧化酶生及脂质过氧化物的变化情况。与一相比,灌胃小鼠苦荞叶提取物能明显提高其血液、肝脏和心脏中的超氧化物歧化酶和谷胱苷肽过氧化物酶的活性,降低脂质过氧化产物－丙二醛的含是 对过氧化氢酶的活性变化无明显规律。说明苦荞叶提取物中有一定量的抗氧化物质,能有效地作体内的自由基,具有较好的抗氧化和抗脂质过氧化作用。