荧光实时定量PCR定量水体中日本血吸虫尾蚴方法的建立

摘要：目的 建立快速、高效、特异的定量水体中尾蚴的数量和检测水体中日本血吸虫尾蚴残余基因组DNA的方法,来评估水体受日本血吸虫尾蚴污染的程度。方法 根据日本血吸虫基因组DNA中的三个多拷贝序列Sjrh1.0（序列号：U92488.1）、18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrRNA)序列（序列号：AY157226.1）和逆转录转座子SjR2的G55A序列（G55A）（序列号：AF412221.1）,设计常规PCR引物和荧光PCR引物,比较选取较好的靶序列建立SYBR GreenI 实时定量PCR方法,绘制尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线,并对疫水中日本血吸虫尾蚴残余的基因组DNA进行检测。结果 尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线有良好的线性关系,相关系数r2为0.9186,和重复实验的变异系数小于3%。结论 本方法特异性高,灵敏,可定量水体中尾蚴数,重复性好,对疫水检测有一定的预警作用。     

检测水体日本血吸虫毛蚴PCR方法的建立

目的建立一种灵敏、特异的痕量检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。方法取感染6～8w日本血吸虫的小鼠肝脏,碾磨后沉淀,孵化并利用间接连续离心法富集毛蚴,采用蛋白酶K-苯酚法提取毛蚴基因组DNA。登陆GenBank查询获得日本血吸虫保守序列18S小亚基单位核糖体脱氧核酸(18SrDNA)基因,利用引物设计软件PrimerPremier5.0和Oligo6自主设计一对引物,建立检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。梯度稀释血吸虫毛蚴基因组DNA进行PCR方法的灵敏性试验,设置阴性对照,PCR产物通过电泳鉴定。结果 PCR扩增日本血吸虫毛蚴得到特异性DNA片段,片段长度为463bp,阴性对照组无扩增产物。PCR法可检测出日本血吸虫毛蚴DNA的最低浓度为62.5pg/μL。结论建立的检测日本血吸虫毛蚴PCR方法灵敏、特异,具有一定的预警作用。     

HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA和TCT检测在宫颈上皮内瘤变筛查中的应用

目的分析人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)E 6/E 7 mRNA、第二代杂交捕获技术(hybrid Capture,HCⅡ)和薄层液基细胞学技术(thinprep cytology test,TCT)在宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)筛查中的效能,选择适宜的分流筛查方案。方法采用病例-对照研究设计,80例CINⅠ~+的病例样本为HCⅡ或TCT筛查阳性并经组织学诊断;132例正常或炎症标本包括:组织学诊断正常或炎症的标本;HCⅡ阴性,TCT阴性且HPV E 6/E 7 mRNA均为阴性的标本。检测方法分别为:TCT进行细胞学检测、用b-DNA技术检测其HPV E 6/E 7 mRNA和用HCⅡ检测HPV DNA。结果在212例正常或宫颈炎和CIN标本中,HCⅡ的阳性率(37.74%)显著高于HPV E 6/E 7 mRNA的阳性率(25.94%)(P0.05);与TCT的阳性率(31.60%)比较差异无统计学意义(P0.05)。TCT的检出率高于HPV E 6/E 7mRNA的检出率,但差异无统计学意义(P0.05)。HPV E 6/E 7 mRNA与HCⅡ的符合率最高,Kappa为0.733,P=0.000;其次为HC II和TCT的符合率,Kappa为0.564,P=0.000;HPV E 6/E 7 mRNA与TCT的符合率,Kappa仅为0.519,P=0.000。并且,在HCⅡ检测结果阳性的67例CINⅠ~+样本中,HPV E 6/E 7 mRNA检测或TCT检测结果皆为阳性。而在HCⅡ阳性的13例正常或炎症样本中,HPVE 6/E 7 mRNA+或TCT结果阳性仅有7例(53.85%)。结论在CINⅠ~+分流筛查方案中,HPV E 6/E 7 mRNA和TCT共同作为HCⅡ阳性分流筛查的方法,可有效降低HCⅡ的假阳性。     

苏州地区GSP~(TM)检测17α-羟孕酮的性能验证及切值建立

目的评估全自动荧光免疫分析仪GSP~(TM)检测17α-羟孕酮(17α-OHP)的分析性能,并初步建立应用于先天性肾上腺皮质增生症(CAH)筛查的17α-OHP切值。方法通过检测试剂盒自带标准品B/D/E三个浓度、试剂盒自带高、低水平质控品,和试剂盒自带的A-E六个浓度的标准品,分析GSP~(TM)系统的精密度、正确度和线性范围。检测临床新生儿血片样本3063例,以99.5%百分位数的17α-OHP水平暂定为初始切值。结果 GSP~(TM)筛查系统检测B/D/E中17α-OHP批内变异系数为3.98%~5.97%,均小于厂家声明的8.7%;批间变异系数为4.32%~8.52%,均小于厂家声明的9.2%。GSP~(TM)系统检测的低、高质控品浓度平均值分别为20.65 nmol/L和140.67 nmol/L,都在试剂盒声明的允许范围之内。线性标本的检测值和理论值的线性方程为y=1.1196x-1.7049,相关系数的平方(R2)为0.9998。GSP~(TM)系统TSH测定浓度值与1235系统的测定值之间呈现显著的正相关,Spearman r=0.615,P0.001。GSP~(TM)筛查系统检测结果99.5百分位数的17α-OHP水平为15.50nmol/L。结论GSP~(TM)系统对17α-OHP的定量性能符合厂家声明的要求,应用于新生儿CAH筛查是可行的。本中心初步采用的GSP~(TM)筛查新生儿CAH的17α-OHP切值为15.50nmol/L。     

C14∶1/C12∶1在新生儿筛查极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症中的应用价值

目的探讨非衍生化串联质谱法(MS/MS)中十四烯酰基肉碱(C14∶1)/十二烯酰基肉碱(C12∶1)在新生儿筛查极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(VLCADD)中的应用价值, 并探索筛查VLCADD的最佳指标组合方案。方法回顾性分析2014年1月至2021年12月南京市新生儿疾病筛查中心和苏州市新生儿疾病筛查中心17例MS/MS筛查发现并经酰基辅酶A脱氢酶极长链(ACADVL)基因确诊的VLCADD患儿和423 507名经MS/MS筛查正常的新生儿资料。采用受试者工作特征(ROC)曲线分别确定所有新生儿组、足月新生儿组和正常出生体重新生儿组C14∶1/C12∶1筛查VLCADD的截断值。同时将不同指标单独或联合组成5个结果判读方案, 分别为方案1(C14∶1/C12∶1)、方案2(C14∶1)、方案3(C14∶1+C14∶1/C2+C14∶1/C16)、方案4(C14∶1/C12∶1+C14∶1)和方案5(C14∶1/C12∶1+C14∶1+C14∶1/C2+C14∶1/C16), 并计算各方案的检出率、假阳性率、阳性预测值, 采用χ2检验比较其筛查效率。结果所有新生儿组、足月新生儿组和正...     

苏州地区1003746例新生儿先天性甲状腺功能减低症筛查结果分析

目的 回顾分析苏州地区新生儿先天性甲状腺功能减低症(CH)筛查情况及新生儿促甲状腺素(TSH随月份的变化。方法 选择2013年4月至2021年12月出生的1003746例新生儿,于出生72 h并充分哺乳后采集足跟血,制成干血滤纸片,运用时间分辨荧光分析法(Wallac 1420、Wallac 1235和GSP三个平台)检测足跟血TSH水平,确诊患儿给予规范治疗并定期随访。结果 共确诊CH患儿637例,CH整体发病率为1/1576,随年份的变化趋势不显著,χ²=12.022,P=0.150。Wallac 1420、Wallac 1235和GSP三个平台筛查人群的CH发病率无统计学差异,χ²=0.825,P=0.662;初筛阳性率依次升高,都具有显著差异;召回复查阳性率依次升高,但是Wallac 1420和Wallac 1235之间差异无统计学意义,都显著低于GSP;阳性预测值依次降低,但是Wallac 1420和Wallac 1235之间差异无统计学意义,都显著高于GSP。不同月份之间CH发病率无统计学差异,χ²=19.6...     

江苏省苏州市苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变特点

目的探讨江苏省苏州市苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变特点。 方法选择2008－2011年,于上海新华医院通过串联质朴技术、苯丙氨酸负荷试验及尿蝶呤检测确诊分型的江苏省苏州市内25例PKU患儿及其父母为研究对象,通过SNaPShot基因分型技术和二代测序(NGS)技术,检测25例PKU患儿及其父母的PAH基因的突变。采用Sanger测序验证上述2种测序的结果,并分析苏州市PKU患儿PAH基因突变特点。本研究遵循的程序符合南京医科大学附属苏州医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,并与患儿监护人签署临床研究知情同意书。 结果SNaPShot基因分型技术、NGS技术检测本组受试者PAH基因突变结果与Sanger测序结果一致。25例PKU患儿中,运用SNaPShot基因分型技术,共检测出PAH基因的9种突变类型,分别为Exon7-R243Q、Exon6-Y204X、Exon7-R241C、Exon5-IVS4-1、Exon12-R413P、Exon3-R111X、Exon7-R261Q、Exon10-W326X及Exon11-Y356X,PAH基因突变检出率为58.0%(29/50)。其中10例患儿可通过SNaPShot基因分型技术检测到PAH基因纯合突变或复合杂合突变,家系分析可提供100%的基因诊断信息。对另15例不能提供100%基因诊断信息的PKU患儿运用NGS技术进行检测,在其中12例患儿中检测到PAH基因复合杂合突变,家系分析可提供100%的基因诊断信息;其余3例患儿仅检测到PAH基因单位点杂合突变。运用NGS技术发现了PAH基因的另外15种突变,包括突变频率为4%的A434D、V399V和Y325X 。上述2种方法对PAH基因总突变的检出率为94%(47/50)。 结论江苏省苏州市PKU患儿的PAH基因热点突变包括R243Q、Y204X、R241C、IVS4-1、R413P、R111X、A434D、V399V和Y325X。运用SNaPShot基因分型技术检测PAH基因突变,具有一定临床应用价值。     

2010年-2012年苏州地区新生儿先天性肾上腺皮质增生症筛查结果分析

目的使先天性肾上腺皮质增生症患儿在新生儿期得到有效治疗,了解苏州地区先天性肾上腺皮质增生症的发病率。方法采用时间分辨荧光免疫分析法检测新生儿滤纸干血片上的足跟血17α-羟孕酮（17α—OHP）浓度,17α—OHP浓度大于等于切值,则重采血复查．复查值仍大于等于切值,则为疑似病例。疑似病例再测静脉血电解质、促肾上腺皮质激素、睾酮、孕酮、雌二醇进行确诊。结果2010年9月至2012年11月共筛查南京医科大学附属苏州医院、太仓市、吴江市和昆山市新生儿96423例,确诊先天性肾上腺皮质增生患儿5例,其中3例得到有效治疗。CAH患儿的17α-OHP水平明显高于正常新生儿的17α—OHP水平。春季和冬季新生儿17α—OHP平均水平明显高于夏季和秋季。春季、夏季、秋季和冬季新生儿17α—OHP水平的95％分位值和99％的分位值分别为（21．75,32．33）,（13．31,22．50）,（15．18,24．43）和（22．42,33．93）。结论DELFIA检测17α—OHP水平能够及时筛查出失盐型和单纯男性化型患儿。苏州市新生儿CAH的发病率为1／19285。CAH筛查切值在夏季和秋季应该有所降低,而在春季和冬季应该有所提高。     

高危新生儿中17α-羟孕酮（17α-OHP）水平的研究

目的分析高危因素包括出生体重、胎龄及其他高危因素对新生儿17α-OHP水平分布,为新生儿肾上腺皮质增生症（CAH）筛查切值的优化提供参考。方法对苏州市新生儿疾病筛查中心2ol0g-8月至2ol4年1月CAH筛查资料进行回顾性分析。运用非参数检验Wilcoxon检验比较性别、胎龄和体重各组之间的统计学差异,通过同时固定性别、胎龄和体重三因素,分析其他高危因素对新生儿17α-OHP水平的影响。结果新生儿17α-OHP水平呈正偏态分布,高危新生儿l7α-OHP水平（中位数为8.52nmol／L）显著高于正常新生儿17α-OHP水平（中位数为6.27nmol/L）,wilcoxon=l.43×108,P=0.000。男性新生儿l7α-OHP水平（中位数为6.81nlnol／L）显著高于女性新生儿17α-OHP水平（中位数为6.33nmol／L）,Wilcoxon=3.77×108,P=0.000,但不是独立影响因素。早产新生儿17α-OHP水平（中位数为11.40nmol/L）显著高于足月新生儿17α-OHP水平（中位数为6.36nmol／L）,Wilcoxon=4.40×108,P=0.000;通过对是否高危、性别和体重同时分层比较表明早产新生儿17α-OHP水平均显著高于足月新生儿17α-OHP水平。不同出生体重新生儿17α-OHP水平不同,极低出生体重新生儿l7α-OHP水平（中位数为13.15nmol／L）显著高于低出生体重新生儿17α-OHP水平（中位数为10.60nmol／L）,Wilcoxon=2.42×105,P=0.000;低出生体重新生儿17α-OHP水平显著高于正常出生体重新生儿17α-OHP水平（中位数为6.43nmol／L）,Wilcoxon=6.77×108,P=0.000;正常出生体重新生儿17α-OHP水平显著高于巨大出生体重新生儿17α-OHP水平（中位数为6.25nmol／L）,Wilcoxon=4.25x107,P=0.000,出生体重对新生儿17α-OHP水平的作用可能受到性别的影响。男性和女性正常体重足月的高危新生儿17α-OHP水平均高于男性和女性正常新生儿17α-OHP水平,Wilcoxon=1.43×108,P=O.000和Wilcoxon=1.24×108,P=0.000。巨大出生体重?     

目标序列捕获二代测序技术在苯丙酮尿症基因诊断中的应用

 目的  评估目标序列捕获二代测序技术在苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)基因诊断中的应用价值。方法  采用目标区序列捕获及第二代测序技术对9例经典型PKU患者的苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因进行检测;采用Sanger测序技术对患者及其父母基因突变型进行验证。结果  9例患者检测到PAH基因的12种致病性突变,包括7种错义突变(p.I65T、p.F161S、p.Q204C、p.R241C、p.L242F、p.R243Q和p.Q375E),2种无义突变(p.R111X和p.Y356X),3种剪接突变［c.442 1G>A(IVS4 1G>A)、c.1315+6T>A(IVS12+6T>A)和c.1316 2A>C(IVS12 2A>C)］,以及3种非致病性的变异(p.Q232Q、p.V245V和p.L385L),致病性突变均来自患者父母。其中,2个致病性突变未见报道,分别为c.1316 2A>C和p.Q375E(CAA >GAA)。结论  目标序列捕获二代测序可以准确检测出PAH基因突变,对遗传病因明确的疾病具有一定的临床应用价值。