肿瘤血管抑制肽alphastatin重组腺伴随病毒的制备

目的构建并产生肿瘤血管抑制肽alphastatin(Al)重组腺伴随病毒(rAAV)载体。方法将目的基因alphastatin插入载体质粒pSSHG-巨细胞病毒(CMV)的EcoRI和BamHI位点,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-Al。用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒,包装质粒pAAV/Ad及已构建的重组腺伴随病毒载体质粒,使用三质粒共转染法转染293细胞,包装得到腺伴随病毒(AAV)-Al。采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀回收纯化,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果重组病毒rAAV-Al滴度约为2×1012颗粒/ml。结论成功制备了重组病毒rAAV-Al,提供了一种生产足量安全的rAAV-Al简单易行的方法,为肿瘤的基因治疗实验奠定了基础。     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景:胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用.目的:构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒.方法:将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒.采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞.结果与结论:重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内.免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1.     

动物模型中人骨形态发生蛋白2重组腺病毒活性观测

目的:利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒,并进行体内表达,测定活性;为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法:实验于2000-05/2002-06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因,体外同源重组构建重组腺病毒后,随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组,每组15只,将纯化后的重组腺病毒50μL注入SD大鼠股部肌肉陷窝病损处,通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果:6周后治疗组可见明显骨诱导形成,2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组,重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论:应用于动物实验中目的基因表达,并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试,且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功,也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。     

腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应.方法 应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率.结果 克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因.MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48 h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小.Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30 h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%.结论 通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的.     

par-4 SAC基因的克隆及序列测定

目的：利用基因工程技术对par-4 SAC进行基因克隆并测定其序列，为进一步诱导肿瘤细胞靶向性凋亡的基因治疗奠定基础。方法：采用非对称互补引物／模板法，制备两端含有酶切位点的par-4 SAC的cDNA，PCR产物克隆人pGEM—T Easy载体并转化感受态大肠杆菌E．coli DH5α菌株，随机挑取数个菌落，筛选鉴定并测序。结果：经酶切鉴定、测序分析，表明所插入的基因片断为par-4 SAC基因，与设计完全相同。结论：应用非对称互补引物／模板法克隆par-4 SAC基因是成功及可行的。     

可分泌表达神经保护肽的重组慢病毒对闭合性脑损伤小鼠的神经保护作用

目的：通过滴鼻给药途径,给予闭合性脑损伤小鼠可分泌表达神经保护肽NAP的重组慢病毒,观察该重组病毒经鼻-脑通路对中枢神经系统的保护作用,为携带可分泌表达NAP的重组慢病毒治疗神经系统退行性疾病提供理论依据。 方法：选用8~12周成年雄性昆明小鼠54只,随机分为4组：空白对照组10只（Control组）、重锤加害组20只（CHI组）、重组慢病毒rLent/NT4-NAP保护组20只（rLent组）和重组慢病毒rLent/GFP组4只（GFP组）。观察各组小鼠的死亡率、神经功能损伤（NSS）评分、脑水肿含量和病理改变情况。应用共聚焦显微镜观测GFP组小鼠鼻黏膜、嗅神经和脑组织内绿色荧光表达情况。 结果：rLent组小鼠死亡率（15％）明显低于CHI组小鼠（55％）;rLent组小鼠NSS评分在创伤后1、3、5和7 d均显著低于CHI组（P<0.01）; rLent组小鼠创伤后24 h的脑水肿含量明显低于CHI组（P<0.01）;HE染色显示rLent组小鼠病理改变明显轻于CHI组;GFP组仅在鼻黏膜处可见呈条索样的绿色荧光,而在嗅神经及大脑则未发现绿色荧光。 结论：分泌表达NAP的重组慢病毒可感染鼻黏膜细胞,分泌表达的短肽NAP能够改善闭合性脑损伤小鼠的神经功能;未加装分泌表达元件的重组病毒rLent/GFP仅能感染鼻黏膜细胞,不能通过血脑屏障进入中枢神经系统。     

生活饮用水中砷汞氢化物发生原子荧光法同时测定

砷和汞都是具有蓄积作用的有毒有害元素,在生活饮用水卫生检测中都被列为重要的检测指标.现行的GB/T5750 -2006中砷、汞的检测方法第一法均为氢化物发生原子荧光法, 在实际工作中可利用双道进行砷汞同测,能大量节省时间,提高工作效率,且在精密度、准确度及线性关系等方面均能得到满意的结果,非常适用于日常的分析检测工作.     

抗丁型肝炎病毒lgM抗体检测试剂盒的制备及应用

本文报告用基因工程生产的HDAg和高效价的抗-HD阳性血清,成功地制备了检测抗-HDIgM的ELISA试剂盒。同国外同类产品比较,其灵敏度为93.9％,特异性为100％。本试剂与甲乙肝抗原无交叉反应,不受类风湿因子的干扰。经临床应用及国内8省市的流行病学调查,均取得了较满意结果。