乳糖诱导鸡β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达

目的研究用乳糖作为诱导剂对鸡β-防御素3(Gal-3)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。最优表达条件为终浓度2 g/L乳糖37℃下诱导3 h,可以达到良好的诱导效果。结论乳糖可以诱导Gal-3基因表达,并取得良好效果,为工业化生产提供了良好的实验参考和借鉴。     

基底节区脑出血破入脑室并发脑积水的手术治疗

目的 探讨基底节区脑出血破入脑室并发脑积水病人的手术方式及疗效.方法 107例基底节区脑出血破入脑室并发脑积水病人随机分为A、B2组.A组54例患者行开颅基底节区脑内血肿清除与沟通脑室引流脑脊液,B组53例仅行脑内血肿清除术.结果 A组患者术后复查头颅CT示脑内血肿清除彻底,脑积水缓解.B组患者术后24 h内复查头颅C...     

FGF21[Tyr20]突变体的克隆、表达及纯化

目的：将成纤维细胞生长因子21(FGF21)第20位氨基酸进行突变后,在大肠杆菌中表达,并进行纯化和生物活性检测。方法：以野生型的FGF21为模板,将FGF21第20位氨基酸Tyr进行PCR定点突变成Phe后与小分子泛素样修饰物（SUMO）融合,克隆至pET22b表达载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］,克隆至BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blotting法进行鉴定,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,SUMO蛋白酶将SUMO切除,Sephadex G-50除盐。结果：通过PCR定点突变,成功地将FGF21第20位氨基酸进行了突变,重组质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］经PCR和双酶切鉴定后测序与预期结果相符。经SDS-PAGE电泳分析,蛋白为可溶性,纯化后成功获得FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白,Western blotting分析显示FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白与FGF21抗体有特异性反应。结论：成功构建并高效可溶性表达SUMO-FGF21［Tyr²⁰］的突变体基因,获得FGF21［Tyr²⁰］蛋白。     

T-2毒素研究进展

T-2毒素是单端孢霉烯族化合物之一,是毒性非常强的一种真菌毒素。是谷物和谷类食品的主要污染源之一,对人类和动物的危害较大。目前,T-2毒素对人和动物的毒性作用受到社会的广泛关注,已成为热点研究课题之一。本文综述了T-2毒素的产生、理化性质以及检测方法,特别是对T-2毒素的毒性研究展开探讨,并对目前研究的不足之处和今后的研究方向进行了讨论。     

HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

目的：在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒（HSV-2）糖蛋白D（gD2）胞外区基因,检测其免疫原性。方法：以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒（P4）,通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠（gD2组）,以PBS作为阴性对照（PBS组）,ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果：PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×10⁹ pfu·mL^-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。     

融合表达载体pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化

目的：设计合成小泛素修饰物-成纤维细胞生长因子受体4（SUMO-FGFR4）基因,构建pET22b-SUMO-FGFR4表达载体,并对其表达条件进行优化。方法：采用Overlap PCR方法制备SUMO-FGFR4融合基因,并连接到原核表达载体pET22b中,获得pET22b-SUMO-FGFR4重组表达载体。以乳糖为诱导剂,观察乳糖浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间和乳糖的添加方式等因素对SUMO-FGFR4蛋白表达量的影响,确定最佳诱导条件,并进行重组蛋白的可溶性分析。结果：pET22b-SUMO-FGFR4表达的融合蛋白在相对分子质量40000处显示目标条带,并与FGFR4抗体特异性结合。融合蛋白在乳糖终浓度为1.0 g·L^-1、诱导时间为3 h、诱导时机A（600）值为 0.8、诱导温度为37 ℃时表达量最高,乳糖的添加方式对SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量无明显影响。乳糖作为诱导剂比传统诱导剂IPTG诱导SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量高7.5%,融合蛋白以包涵体形式为主。结论：以乳糖作为诱导剂,成功表达了SUMO-FGFR4融合蛋白,确定了融合蛋白的最佳表达条件。     

镰刀菌T-2毒素对人急性早幼粒白血病细胞HL60增殖与凋亡的影响

目的研究镰刀菌属真菌产生的倍半萜烯类化合物T-2毒素对体外培养急性早幼粒白血病细胞HL60生长抑制与凋亡诱导的作用。方法体外培养的HL60细胞经0、4、8、16和32μg/ml的T-2毒素处理48h,以MTT法检测T-2毒素对HL60细胞的生长抑制作用;吉姆萨染色观察细胞凋亡形态;流式细胞术(FCM)检测凋亡率;FCM及Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达情况。结果 MTT显示T-2毒素对HL60细胞的增殖具有抑制作用,并呈剂量依赖关系。形态学观察显示早幼粒白血病细胞出现明显凋亡形态特征。FCM定量检测表明,T-2毒素各处理组细胞凋亡率均高于对照组,并随T-2毒素浓度升高而增加。FCM和Western blot结果显示,T-2毒素处理后HL60细胞Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下降。结论T-2毒素可剂量依赖地抑制体外培养的HL60细胞增殖并诱导凋亡。     

鸡β-防御素的研究进展

鸡β-防御素在动物机体组织中分布较为广泛,在多种组织上皮细胞中均可合成,是机体抵御外界微生物侵袭的重要化学屏障,在机体内源性免疫防御中具有重要作用.它作用于微生物细胞膜的防御机理以及不易引起耐药性的特点,已引起各国研究者的日益重视.本文着重描述了鸡β-防御素的起源与分子结构、抗菌作用机理、抗菌活性、获取方法、基因工程及...     

重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：以毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21（hFGF21）,为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法：根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastoris GS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut⁺,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果：PCR　扩增出约569 bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明：FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20 000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论：成功克隆FGF21基因,并在Picha pastoris　SMD1168中获得表达。