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1.
目的构建及表达人cTnI(28-110aa)-linker-TnC融合蛋白。方法应用PCR技术从人心脏cDNA文库中扩增出cTnI(28-110aa)和TnC基因,通过引物设计在两者之间加上linker序列即编码19个中性氨基酸残基TS-(G4S)3-AC的序列,克隆PCR产物,并构建成pET28a-cTnI(28-110aa)-linker-TnC表达质粒,转化人大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达,NTA树脂亲和层析纯化后检测其纯度和免疫反应性。结果成功构建了cTnI(28-110aa)-linker-TnC融合蛋白的基因,并在大肠杆菌中实现可溶性高表达,在摇瓶中的表达量为20mg/L.经一步NTA树脂亲和层析纯化,获得条带单一的目的蛋白,采用进口全自动免疫检测系统鉴定证实.目的蛋白有较高的免疫反应性。结论采用原核表达方法获得了具有高纯度和高免疫反应活性的cTnI(28-110aa)-linker-TnC融合蛋白。 相似文献
2.
目的 研究miR-125b在乳腺癌中的表达,尤其是其对乳腺癌迁移侵袭的作用以及该过程所涉及的分子机制。 方法 (1)用实时荧光定量PCR检测23对临床组织样本中miR-125b及靶基因ETV6的表达水平;(2)用实时荧光定量PCR、双荧光报告验证靶基因;(3)在细胞中瞬时转染miR-125b mimics,并用划痕、transwell迁移、侵袭及Western blot检测体外乳腺癌细胞的迁移侵袭能力及上皮间质转化的变化;(4)用靶基因敲减实验进一步验证靶基因的准确性。 结果 (1)与正常组织相比,乳腺癌组织中miR-125b的表达显著降低(P<0.001),ETV6的表达显著增高(P<0.05);(2) ETV6为miR-125b的靶基因;(3)与对照相比,上调的miR-125b可显著抑制Hs578T的迁移和侵袭(P<0.001),并抑制EMT的发生;(4)敲减ETV6对Hs578T的作用与miR-125b过表达一致。 结论 miR-125b在乳腺癌中低表达,miR-125b通过靶向结合ETV6 3’UTR抑制该基因的表达,从而抑制Hs578T的迁移、侵袭及上皮间质转化的发生。因此,miR-125b可作为抑癌基因发挥作用。 相似文献
3.
目的:比较人乳腺癌亲代敏感株MCF-7和多耐药细胞株MCF-7/A中ALDH1,P-gp及CD44v6的表达差异,探讨多耐药与侵袭转移作用机制。方法:以阿霉素低浓度加量持续诱导法,建立人乳腺癌多耐药细胞模型株MCF-7/A,用ALDEFLUOR分析法检测乳腺癌干细胞功能性标志物ALDH1阳性细胞在亲代敏感株MCF-7与多耐药细胞株MCF-7/A中所占比例,Transwell侵袭实验论证乳腺癌胞耐药是否伴随相应侵袭转移能力的改变,免疫细胞化学染色及荧光定量PCR分析亲代敏感株MCF-7与多耐药细胞株MCF-7/A中MDR1(P-gp)和CD44V6的表达变化。结果:耐药细胞株MCF-7/A较亲代敏感株ALDH1阳性细胞比例数明显增高;耐药细胞株MCF-7/A穿膜细胞数明显多于敏感细胞株MCF-7;耐药细胞株MCF-7/A中P-gp和CD44v6表达均明显高于亲代敏感细胞株。结论:乳腺癌的多耐药不仅包含获得性耐药细胞比例增加,同时伴有肿瘤干细胞的富集造成的内在性耐药增加,耐药的乳腺癌细胞伴有侵袭能力增强。 相似文献
4.
目的通过比较恒温扩增技术(SAT)、GeneXpertMTB法和快速液体培养(BACTECTMMGITTM960System)检测结核分枝杆菌的技术特点,评估SAT在肺结核诊断中的应用价值。方法对108例疑似肺结核患者和15例非肺结核患者痰样本分别进行抗酸染色镜检、快速液体培养、GeneXpertMTB及SAT检测,分析比较这几种检测方法的特点。结果SAT、GeneXpertMTB、快速液体培养的阳性率分别为62.0%(67/108)和64.8%(70/108)、50.0%(54/108);以临床诊断为标准,3者的灵敏度分别为65.7%(67/102)、68.6%(70/102)和47.1%(48/102),特异度分别为100%(21/21)、100%(21/21)和71.4%(15/21)。结论SAT技术不仅简便快速,而且可以提高临床肺结核诊断的阳性率及灵敏度,对肺结核快速诊断有重要价值。 相似文献
5.
目的:评估重组融合蛋白谷胱甘肽S-转移酶(GST)-肌钙蛋白Ⅰ(TnI)(28~110aa)的实用价值。方法:诱导表达菌株BL21-PGEX-4T-3/TnI(84~330bp)表达GST—TnI(28~110aa),谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化融合蛋白.经自动免疫分析仪检测其免疫反应性。采用双抗体夹心ELISA法检测稳定性,并与天然提纯心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)抗原进行比较。结果:GST-TnI(28~110aa)融合蛋白表达水平高,具较高免疫反应性。在37℃条件下,GST-TnI(28~110aa)融合蛋白第3天免疫反应性仍保留60%,而人心肌提纯的cTnI在第3天免疫反应性几近丧失。结论:GST-TnI(28~110aa)融合蛋白具较高的免疫反应性,与天然cTnI相比较,重组GST-TnI融合蛋白稳定性好,有望作为cTnI测定的候选参考标准品。 相似文献
6.
上个世纪90年代起。心肌肌钙蛋白(cTn)用于临床诊断心肌损伤.由于心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)可检出微小心肌损害,现已成为心肌细胞损伤敏感度和特异度最强的标志物之一,是快速诊断急性心肌梗死(AMI)和急性冠脉综合征(acute coronary syndromes.ACS)、协助ACS危险分级和反映其预后的主要生化标志。大量临床研究表明cTnI在诊断心肌损伤时有高度的特异度及灵敏度。是诊断心肌损伤的“金标准”。 相似文献
8.
目的建立人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A,对其生物学特性进行初步分析评价,为后续乳腺癌多药耐药机制研究提供一株较理想的细胞模型.方法以阿霉素(ADM)为诱导药物,人乳腺癌细胞系MCF-7为诱导对象,采用ADM低浓度持续加量诱导方法,建立人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A,比较两组细胞形态变化和倍增时间,MTT法测定细胞耐药倍数及多药耐药指数,实时荧光定量PCR检测MDR1、MMP-2、CD44v6 mRNA表达水平.结果建成的MCF-7/A耐药细胞株,耐ADM指数为74,撤药培养60d后耐药指数仍维持在50以上,耐药性稳定,并与多种化疗药物有交叉耐药性,MCF-7/A耐药细胞株撤药培养倍增时间较亲本细胞明显缩短,MDR1、MMP-2、CD44v6 mRNA表达水平较亲本细胞均有明显增加(均P<0.01).结论建立的MCF-7/A模型具有多药耐药细胞的基本生物学特性,可用于乳腺癌多药耐药及侵袭转移机制的研究. 相似文献
9.
目的:探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)及抗核抗体(ANA)联合检测的临床意义。方法:采用间接免疫荧光技术(IIF)检测并回顾性分析84例SLE患者和52例健康体检者(正常对照组)血清ANCA阳性率及荧光免疫模型,同时采用酶标免疫吸附法(ELISA)进行抗核抗体(ANA)检测。结果:84例SLE患者中,ANCA阳性28例(33.3%),正常对照组无ANCA阳性。28例AN-CA阳性组中,狼疮活动18例(64%),56例ANCA阴性组中狼疮活动22例(39.3%),两组阳性率差别有统计学意义(P<0.01);84例SLE患者中ANA检出58例(69.0%),正常对照组52例中2例ANA阳性,阳性率为(3.84%)。ANCA与ANA联合检测,ANCA阳性ANA阳性共70例,敏感性为83.3%,显著高于两者单独检测时的敏感性(P<0.01)。结论:联合ANCA、ANA检测有助于提高SLE的诊断的敏感性,ANCA与狼疮活动力具有相关性。 相似文献
10.
心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)是诊断急性心肌梗死的"金标准"[1-2].心肌损伤时,外周血中90%以上的cTnI以I-C复合物形式存在[3-4],而28~110间的肽段与C形成复合物稳定,我们根据患者血清中cTnI存在形式,通过引物设计构建pGEX4T-3-cTnI(28~110aa)-C原核表达系统,在大肠杆菌中实现cTnI(28~110aa)-C复合物的稳定可溶性高表达.然后,用该融合蛋白抗原制备抗cTnI单克隆抗体及多克隆抗体,为建立检测方法,提高检测灵敏度做前期准备. 相似文献