抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv基因连接到pBAD/gⅢA表达载体,转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果:scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser)。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类,全长351 bp,可编码117个氨基酸;其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,全长318 bp,可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-mycMr约为31 000,结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。     

丙硫氧嘧啶(PTU)诱导药物性肝损伤的研究进展

正药物性肝损伤(DILI)作为一种主要的临床问题,越来越受到医学界的重视。抗甲状腺药物(antithyroid drug,ATD)是造成DILI的其中一类药物,其临床表现为典型的特异质性肝损伤(idiosyncratic drug-induced liver injury,IDILI),具有不可预测性,个体差异显著,与药物剂量常无相关性,临床表现多样     

面对特殊挑战,建立《医学微生物学》实验课程新体系

为适应医学教育的发展和社会对新型医学人才的需要,以及配合北京大学医学部"新途径"教育教学改革模式,北京大学基础医学院病原生物学系根据国家相关政策法规的要求、自身的专业特点和发展,对医学微生物学实验课程进行了一系列的改革尝试,对实验教学内容进行及时梳理调整、更新和优化。在强化本专业特有的基本验证性实验的基础上,注重与相关学科交叉融合,开设了不同层次的综合性实验,建立了既能兼顾本专业特色,又与目前医学教育发展相适应的新型实验课程体系,并配套建设了生物安全二级(BSL-2+)教学准备实验室和实验课教学电子化、信息化模式,在现有的基础上尽可能使微生物学教学实验室符合国家政策法规的要求。"新途径"教改框架下医学微生物学实验课程体系的建立与实践,是在当前形势下微生物学实验课面对国家法规要求、适应本专业实验教学自身发展和新型人才培养等方面进行了有益探索。     

HIV-1 LTR区转录功能研究进展

作为获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体,HIV-1基因组结构复杂，编码大量调节蛋白与辅助蛋白。转录水平调节主要依赖细胞内前病毒长末端重复序列(long terminalrepeats，LTR)和病毒因子及大量细胞转录因子的相互作用实现。本文就HIV-1 LTR区的转录调节功能的研究进展作一综述。     

HIV合并感染加速HCV白发清除者抗-HCV抗体衰减北大核心CSCD

目的了解HIV合并感染对HCV自发清除患者抗-HCV抗体水平变化的影响。方法2009年和2017年分别对河南省上蔡县王营村有既往献血史人群抗-HCV抗体水平进行回顾性研究,根据2009年调查结果将抗-HCV抗体阳性人群分为4组：HCV慢性感染组（HCVc）、HCV自发清除组（HCVr）、HIV阳性的HCV慢性感染组（HIV＋HCVc）、HIV阳性的HCV自发清除组（HIV＋HCVr）。2017年随访中剔去失访人群、HCV治疗人群和HCV自发清除再感染人群,每组随访人数分别为：HCVc组65人、HCVr组34人、HIV＋HCVc组44人、HIV＋HCVr组24人。对上述4组2009年抗-HCV抗体水平进行横向比较,以及对2009—2017年4组抗-HCV抗体水平变化进行纵向比较分析。 结果2009年横向比较显示,无论HIV是否合并感染,慢性感染组抗-HCV抗体水平均显著高于自发清除组。2009—2017年HCVc和HIV＋HCVc组的抗-HCV抗体水平无明显变化,但HCVr和HIV＋HCVr组的抗-HCV抗体水平均呈显著衰减趋势（P〈0.0001）;HIV＋HCVr组的抗-HCV抗体衰减程度高于HCVr组（P＝0.0039）;HCVr组（r＝－0.5277,P＝0.0017）与HIV＋HCVr组（r＝－0.7532,P〈0.0001）初始抗-HCV抗体水平与抗-HCV抗体衰减幅度呈负相关;HIV＋HCVr组的抗-HCV抗体变化水平与2009年CD4＋T细胞计数基数水平呈负相关（r＝－0.5638,P＝0.0041）;HIV＋HCVr组与HCVr组的抗-HCV阴转率差异有统计学意义（P＝0.0275）。结论HIV合并感染加速HCV自发清除患者抗-HCV抗体衰减,提示在大规模流行病学调查时,HIV感染人群的抗-HCV抗体阳性比例可能被低估。     

慢性乙型肝炎患者外周血CD8^＋T细胞亚群分布和PD-1表达特征研究

目的分析慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血中CD8^＋T细胞及其亚群表面程序性死亡受体-1（PD-1）表达的变化特征及其临床关联性。方法用流式细胞术检测14例CHB患者和15例健康对照者外周血中CD8^＋T细胞及其亚群初始T细胞（TN）、中央记忆T细胞（TCM）、效应记忆T细胞（TEM）、终末效应记忆T细胞（TEMRA）的频数及细胞表面PD-1的表达水平,同时收集患者一般资料、生化指标和乙型肝炎病毒（HBV）病毒学指标等临床资料。使用SAS 9.1统计软件分析数据,应用Mann-Whitney U test分析组间差异,应用Spearman秩相关进行相关性分析,P〈0.05为差异有统计学意义。结果与健康对照组相比,CHB患者的TEMRA亚群在CD8^＋T细胞中的频数显著降低（P=0.012）,总CD8^＋T细胞（P=0.018）及其TEM亚群（P=0.004）表面PD-1的表达水平显著上升。相关性研究显示,CD8^＋TEM细胞表面PD-1的表达水平与HBV DNA载量呈显著正相关（r=0.554,P=0.040）。结论 CHB患者外周血中PD-1阳性的CD8^＋TEM频数升高,且与外周血中HBV DNA载量呈正相关,提示慢性乙型肝炎患者机体内HBV复制的活跃性可能与外周血中CD8^＋T细胞的活化状态,特别是其TEM亚群上PD-1的高表达关联。     

嗜碱性粒细胞在过敏反应和固有免疫应答中的作用研究新进展

嗜碱性粒细胞和肥大细胞都表达高亲和力FcεRI,并在胞质颗粒内含有成熟预释放的组胺。大量研究显示这两种细胞在变应性炎症中起着截然不同的作用。啮齿类动物肥大细胞数量上超过嗜碱性粒细胞,嗜碱性粒细胞也一直被认为在变应性炎症中只起着次要作用。人类嗜碱性粒细胞是早期Th2细胞因子IL-4和IL-13的主要产生细胞,对于Th2免疫应答的发展有着重要作用。嗜碱性粒细胞利用其表达的IL-4、IL-13以及CD40L促进B细胞上IgE抗体类别转换。通过特异性染色技术可以对嗜碱性粒细胞在变应性反应受累的不同器官进行定位。嗜碱性粒细胞的活化并不仅仅局限于抗原-IgE交联反应所诱导,也可以由寄生虫抗原、外源凝集素和病毒超抗原所激发。随着IgE非依赖性活化途径的研究深入,嗜碱性粒细胞在固有性免疫应答和适应性免疫应答中的作用越来越受到关注。     

HIV感染对有偿献血人群HCV感染者预后的影响

目的:观察HIV感染对有偿献血人群中丙型肝炎病毒(HCV)感染者预后的影响.方法:所有研究对象均来自中国中部地区,通过问卷及血液检查共获得133例HIV/HCV合并感染者、152例HCV单纯感染者和29例HIV单纯感染者,对3组患者均随访5 a.结果:HIV/HCV合并感染组、HCV单纯感染组和HIV单纯感染组分别有2...     

CFSE和AnnexinV双标记技术检测细胞毒性T淋巴细胞的杀伤效应

目的 利用CFSE和AnnexinV对靶细胞进行染色,建立一种通过流式细胞仪技术检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤效应的新方法.方法 应用磁珠分 OT-Ⅰ T细胞受体(TCR)转基因小鼠CD8+CTL细胞和脾脏树突状细胞(sDC),将2种细胞和鸡卵蛋白(OVA)抗原肽共培养65 h后分析其细胞分裂增殖、IFN-γ和IL-4细胞内因子及穿孔素、颗粒酶等效应分子的表达特性,收获具备杀伤效应的CD8+CTL细胞.利用预先激活的小鼠CD8+CTL细胞作为效应细胞,CFSE标记的同系小鼠脾细胞作为靶细胞,体内体外2种条件下利用AnnexinV染色靶细胞检测特异性CTL杀伤效应,并与CFSEhigh和CFSElow标记靶细胞检测体内CTL杀伤效应的经典方法进行比较.结果 OT-Ⅰ初始CD8+CTL细胞体外活化培养后有4个分裂峰,54.1%的CTL细胞表达IFN-γ,0.78%的细胞表达IL-4,穿孔素、颗粒酶2种CTL效应分子均为阳性表达,CD8+CTL细胞已经具备CTL杀伤活性.体外实验结果显示OVA+靶细胞在共培养条件下,AnnexinV阳性细胞比例明显高于分离培养条件下[(62.4±3.5)%比(28.3±2.2)%,P＜0.01],OVA-的AnnexinV阳性靶细胞比例在不同培养条件下差异无统计学意义[(20.3±4.8)%比(17.3±2.9)%,P＞0.05].共培养条件下OVA+靶细胞其AnnexinV阳性细胞比例也明显高于OVA-靶细胞(P＜0.01),在分离培养条件下差异则无统计学意义(P＞0.05).活化的CD8+CTL细胞所介导的杀伤效应具有抗原依赖性和部分的细胞接触依赖性.体内CTL实验中,利用CFSE和AnnexinV双标记的方法检测出靶细胞的杀伤率高于未孵育OVA抗原肽的对照组靶细胞[(52.63±8.12)%比(13.84±4.37)%,P＜0.01].而同等条件下利用CFSEhigh和CFSElow双标记的方法检出靶细胞杀伤率为41%.结论 CFSE和AnnexinV双标记靶细胞的方法检测CTL杀伤效应与单纯的使用CFSEhigh和CFSElow标记靶细胞方法有很好的可比性,该策略为利用流式细胞仪技术检测细胞杀伤功能的方法学提供了新的选择.     

鼠抗CD71单抗轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的 获得鼠抗人CD71分子单抗的轻链及重链可变区基因。方法 用一步法提取总RNA,逆转录形成cDNA,设计并合成一套扩增小鼠重、轻链可变区的通用引物,通过PCR扩增基因．分别克隆人pMD18－T载体中,作核苷酸序列分析。结果用重链引物扩增获得长约350bp的片段,用轻链引物扩增获得长约330bp的片段,序列测定获得它们的DNA序列。结论克隆的重链可变区基因长度为348bp,属于小鼠H链可变区IA亚组;克隆的轻链可变区基因长度为336bp,属于小鼠K轻链可变区Ⅱ亚组。