CYP1A2基因沉默及其对三氯乙烯毒性影响

目的 构建细胞色素氧化酶1A2(CYP1A2)基因沉默载体,转染L02人正常肝细胞(简称“L02细胞”),建立CYP1A2沉默细胞株并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响.方法 设计合成短发卡RNA(shRNA),连接到pLKO.1-puro质粒中构建CYP1 A2 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞.筛选CYP1A2沉默细胞株,采用荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法鉴定.分别采用浓度为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L的TCE(设为相应的染毒剂量组)对L02细胞和CYP1A2沉默细胞染毒12h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组(即0.00 mmoL/L染毒剂量组),观察凋亡基因[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)等基因表达的变化.结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的CYP1A2基因干扰序列与设计的shRNA 序列一致.CYP1A2沉默细胞的CYP1A2mRNA和CYP1A2蛋白相对表达水平分别较L02细胞下降75.9％和82.4％(P＜0.01).TCE染毒后,0.25 ～4.00 mmol/L 4个染毒剂量组CYP1A2沉默细胞Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞(P＜0.01);部分0.25 ～4.00 mmol/L染毒剂量组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和c-fos、c-myc k-ras、p53相对表达水平均低于相应染毒剂量组的L02细胞(P＜0.05或P＜0.01).结论 CYP1A2沉默降低TCE对L02细胞凋亡基因和癌基因的活化作用.     

Graves病患者外周血中树突状细胞及相关细胞因子的变化

目的检测Graves病人外周血细胞因子和树突状细胞(DCs)不同亚群的数量和表达情况,初步探讨DCs细胞亚群在疾病中的作用。方法利用流式细胞仪检测30例Graves病患者和30名健康体检者的外周血树突状细胞亚群数量,同时利用ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)及IL-6等细胞因子的水平。结果测得Graves组髓样树突状细胞(p DC)和浆细胞样树突状细胞(m DC)值均高于正常对照组。ELISA检测细胞因子发现,Graves患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均高于正常对照组,其中TNF-α显著升高(P<0.01),而IL-2水平显著低于对照组(P<0.01)。结论 Graves病人中p DC和m DC水平升高,细胞因子分泌失调,Th1/Th2失衡,从而导致机体自身免疫反应的产生。     

三氯乙烯变态反应病人外周血凋亡基因表达水平的研究

目的:探讨三氯乙烯(TCE)变态反应病人外周血凋亡基因BAX、BAD、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的mRNA表达水平变化情况。方法:抽取健康人(对照组)和三氯乙烯变态反应病人(病例组)抗凝外周全血,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)技术检测外周血中BAX、BAD、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的mRNA的表达水平。结果:TCE变态反应病人(病例组)BAX、BAD、Bcl-2基因mRNA表达水平与对照组相比较,分别升高85%1、39%、227%(P<0.01);病例组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因mRNA表达水平也比对照组分别升高130%、231%2、49%(P<0.01)。结论:三氯乙烯病人外周血凋亡基因表达水平明显高于对照组,提示这些凋亡基因可能与TCE引起的变态反应存在一定的关联。     

CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的： 应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的CYP2E1 基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制 研究。     

三氯乙烯药疹样皮炎病人外周血c-fos、c-myc、K-ras和p53 mRNA表达水平的研究

目的:探讨三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)药疹样皮炎病人外周血癌基因c-fos、c-myc、K-ras、p53 mRNA表达水平的变化情况。方法:分别抽取4例健康人(对照组)及4例三氯乙烯致变态反应病人(病例组)抗凝外周全血,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术检测外周血中c-fos、c-myc、K-ras和p53 mRNA的表达水平。结果:与健康对照者比较,三氯乙烯药疹样皮炎病人外周血c-fos mRNA表达水平升高352%,c-myc mRNA升高41%,K-ras mRNA升高136%,p53 mRNA升高64%,两组间上述基因mRNA表达水平的差异均有统计学意义(P0.01或P0.05)。结论:三氯乙烯药疹样皮炎病人外周血癌基因表达水平增加,提示三氯乙烯可能有一定的致癌风险。     

三氯乙烯对CYP1A2 高表达肝细胞株凋亡基因和癌基因的影响

目的： 构建CYP1A2基因高表达载体,转染到L02肝细胞,建立CYP1A2高表达细胞株并检测三氯乙烯对该细胞株凋亡基因和癌基因的影响。方法：根据GenBank提供的CYP1A2基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到CYP1A2高表达L02细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP1A2高表达细胞进行染毒12 h,采用PCR方法检测凋亡基因 (Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因 (c-fos、c-myc、K-ras、p53)mRNA表达的变化。结果：测序证明重组慢病毒高表达载体CYP1A2基因序列与GenBank提供的CYP1A2序列一致,荧光定量PCR检测显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2 mRNA表达比正常L02肝细胞提高317倍,Western blot结果显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2蛋白表达水平比正常L02肝细胞高3.41倍。三氯乙烯染毒后,CYP1A2高表达细胞中凋亡基因Bcl-2 mRNA表达水平与正常肝细胞无显著性差异(P>0.05),而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达水平高于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01)。CYP1A2高表达细胞中癌基因c-myc和p53 mRNA表达水平低于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01),而c-fos和K-ras mRNA则高于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01)。结论：三氯乙烯对CYP1A2高表达细胞凋亡基因和癌基因表达有显著影响,提示CYP1A2是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系。     

CYP2E1基因RNA干扰载体的构建与表达

目的：构建CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体,为研究CYP2E1在药物代谢和环境污染物代谢中的作用提供技术支持。方法：通过NCBI检索CYP2E1序列,设计合成3对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体PLK0．1-puro,将重组质粒转化到感受态JM107中。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒和包膜蛋白质粒共转染到293FT细胞,收集病毒上清,转导肝细胞L02,利用嘌呤霉素筛选得到CYP2E1缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Westernblot鉴定干扰效果。结果：PCR和测序结果证明双链shRNA已经正确插入慢病毒载体PLK0．1-puro,共转染293FT细胞得到高滴度病毒,转导L02细胞筛选出CYP2E1基因沉默细胞,荧光定量PCR检shRNA3的最高抑制效率为86．9％,Westernblot鉴定shRNA3基本无CYP2E1表达。结论：利用慢病毒介导RNAi技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。     

三氯乙烯对肝细胞代谢酶基因与凋亡基因表达的影响

目的：探讨三氯乙烯（trichloroethylene,TCE）对人L02肝细胞代谢酶基因CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1和凋亡基因BAX、BAD、Bcl-2 mRNA表达水平的影响。方法：以1%二甲亚砜（DMSO）为溶剂对照,用不同浓度TCE（0.25、0.5、1.0和2.0mmol/L）染毒L02肝细胞24h,另外用同一浓度1.0mmol/L TCE染毒细胞3～24h,采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术检测L02肝细胞中CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1和凋亡基因BAX、BAD、Bcl-2 mRNA的表达。结果：不同剂量TCE染毒后CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1 mRNA表达明显上升,CYP1A2升高36%～726%,CYP3A4升高56%～525%,CYP2E1升高15%～94%,与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）;凋亡基因BAX、BAD、Bcl-2表达水平也明显升高,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）。用1.0mmol/L TCE染毒3～24h,同样发现肝代谢酶基因和凋亡基因表达增加,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）。结论：TCE可诱导L02肝细胞中代谢酶基因及凋亡基因表达变化,肝代谢酶基因和凋亡基因可能在TCE对肝细胞毒性效应中发挥重要作用。