Cdk5在肾小球足细胞中的表达及作用

目的研究周期素依赖性蛋白激酶-5（Cdk5）及其激活剂p35在肾小球足细胞中的表达及作用。方法分别培养原代小鼠神经细胞、原代小鼠分化成熟的离体足细胞（简称足细胞）以及人胚肾细胞（HEK293细胞）,应用免疫印迹、免疫沉淀及同位素标记等方法检测Cdk5、p35的表达及Cdk5的活性;以原代小鼠分化成熟的离体足细胞为研究对象。分为正常组、ROS组（Cdk5．活性抑制组）、Cdk5siRNA组（Cdk5表达沉默组）,观察Cdk5的表达及活性,并应用Cdk5 siRNA、Cdk5化学抑制剂-Roscovitine进行抑制实验。结果离体培养原代小鼠分化成熟的足细胞中均有Cdk5及p35蛋白的表达;Cdk5在足细胞中具有活性;沉默Cdk5表达、应用Cdk5活性抑制剂Roscovitine抑制Cdk5活性后,可引起足细胞特异性标志物WT1的表达减少,说明足细胞受到损伤,数量减少。结论Cdk5的表达及活性在维持正常足细胞功能中起重要作用。     

血清胱抑素C和β2微球蛋白在老年慢性阻塞性肺疾病诊断早期肾损害中应用

目的分析和评估血清胱抑素C（CysC）和β2微球蛋白（β2-MG）在老年慢性阻塞性肺病（COPD）患者早期肾损伤的监测意义。方法分组：COPD组60例（平均年龄68岁）,对照组（健康体检者,平均年龄65岁）30例;依据缺氧程度分为轻、中、重度缺氧3组;再依据心脏彩色多普勒超声中肺动脉收缩压分为无肺动脉高压和有肺动脉高压两组。测定血清β2-MG、视黄醇结合蛋白（RBP）、CysC、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、估算肾小球滤过率（eGFR）。结果 （1）与对照组比较,COPD组血清β2-MG、CysC明显增高,eGFR降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。而血清Scr、BUN、RBP与对照组比较差异无统计学意义。（2）血清CysC和β2-MG在COPD组均高于对照组,二者在重度缺氧组增高的比例明显高于在轻度和重度缺氧组,二者在重度缺氧组增高的比例明显高于在COPD组（P〈0.05）。（3）血清CysC和β2-MG在无肺动脉高压组及肺动脉高压组的浓度均明显高于对照组,增高的比例分别是36.7%和43.3%,二者在肺动脉高压组增高的比例明显高于无肺动脉高压组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。（4）相关性分析提示,在COPD组,血清β2-MG、CysC的增高与氧分压（SPO2）均存在良好负性相关（r值分别是-0.702和-0.680,P值为0.000）,β2-MG相关系数大于CysC。结论 COPD可致患者肾功能损伤。血清CysC、β2-MG是评估COPD患者早期肾损害的灵敏指标,并与SPO2存在负相关,随缺氧程度加重,血清中β2-MG、CysC浓度增高,其中β2-MG在COPD患者中较CysC与SPO2相关性更好。     

高糖环境诱导胰岛表达p25引起胰岛细胞损伤的研究

目的探讨在高糖环境中p25的表达及其对胰岛细胞损伤及胰岛素分泌的影响。方法实验分为db/db小鼠组(糖尿病组,n=5)和C57/BL小鼠组(正常对照组,n=5),进一步将从C57/BL小鼠胰岛分离的胰岛细胞组分为正常糖浓度糖刺组(5m M)和高浓度糖刺激组(30m M)。研究对象均为雄性小鼠,鼠龄13周,进行胰岛(islets)分离,培养及胰腺组织病理切片。用免疫印迹测定蛋白表达,酶联免疫法测定胰岛素分泌水平,免疫组化染色测定胰岛细胞凋亡。结果 p25在C57/BL组和C57/BL正常糖浓度刺激组的胰岛细胞均无表达,与之比较,p25在db/db组和C57/BL高糖刺激组的胰岛细胞均有明显的表达(P<0.05);与C57/BL组相比较,cleaved caspase3在db/db组胰岛细胞中的表达明显增加(P<0.05);与C57/BL组和C57/BL正常糖浓度组相比较,胰岛素分泌在db/db组和C57/BL高糖刺激组均明显减少(P<0.05)。结论高糖环境可刺激胰岛表达p25,引起胰岛细胞凋亡,减少胰岛素分泌。     

nephrin及WT-1在嘌呤霉素大鼠肾病模型足细胞中的表达及意义

目的应用嘌呤霉素氨基核苷（PAN）模型,研究足细胞相关蛋白nephrin和肿瘤蛋白-1（WT-1）在足细胞中的表达及在肾小球硬化进展过程中的意义。方法单次尾静脉注射嘌呤霉素氨基核苷制作PAN模型,在4、14及20周处死大鼠,取其肾脏,切片,nephrin及WT-1免疫组化染色,半定量分析后进行统计学分析。结果对照组免疫组化染色nephrin沿肾小球毛细血管襻呈较为均匀的黄褐色粗颗粒样的线状分布,4周时与对照组比较PAN组nephrin略有分布不均,部分区域染色减弱或消失（均值为10．23±1．256和8．23±0．88,P〈0．05）,14周时在有节段性硬化的区域nephrin无表达（均值为7．58±0．71和10．23±1．26,P〈0．05）,而在20周时硬化的区域基本无表达（均值为7．88．±0．92和6．08±1．34,P〉0．05）,与对照组比较均有明显减少。4周时WT-1在足细胞核表达,呈深棕黄色粗大颗粒,与对照组比较无统计学意义（均值为10．14±2．02和10．11±1．56,P〉0．05）;14周时PAN组WT-1表达较对照组有所减少（均值为9．02±1．73和6．8±1．89,P〈0．05）;20周时与对照组比较PAN组WT-1明显减少（均值为7．34±1．22和4．43±1．01,P〈0．05）,足细胞数量随着时间的延长依次递减。结论Nephrin的表达在肾小球硬化过程中进行性减少,甚至消失;WT-1的表达随着肾小球硬化的进展逐渐减少。Nephrin和W-1表达的降低均反映足细胞的结构破坏和数量的减少,因此两者表达可反映足细胞损伤和肾小球硬化的关系。     

FTP5通过抑制Cdk5活性调节胰岛β细胞的胰岛素分泌

目的 探讨FTP5通过抑制周期素依赖性蛋白激酶(Cdk5)活性调节高糖环境下胰岛β细胞分泌胰岛素的作用.方法 体外培养小鼠胰岛β细胞株(Min6细胞).①体外抑制实验.将Cdk5活性抑制肽(CIP)和P5蛋白与Cdk5+p25激酶在试管混匀测定酶的活性,分为:p25+Cdk5组、p25+Cdk5+CIP组,p25+Cdk5+P5组.②细胞内试验.应用腺病毒表达空载体(EV),含有p5的重组腺病毒(p5)、和FITC-TAT合成的短肽(FTP5),分别转染细胞并给不同浓度的葡萄糖3 mmol(低糖,LG)和25 mmol(高糖,HG)刺激,分组为LG+EV组、HG+EV组、HG+FTP5组、HG+p5组.用免疫印迹和免疫荧光检测Cdk5和p35等蛋白表达,同位素标记测定Cdk5的活性,酶联免疫吸附试验测定胰岛素的分泌水平.结果 p5与CIP均可抑制Cdk5的活性,且前者的抑制作用更强;①高糖可以诱发p35表达增高,抑制胰岛素分泌;②FTP5和p5均抑制在高糖(25 mmoL)刺激下的Cdk5活性、恢复胰岛素的分泌,FTP5的作用更强(P＜0.05).结论 FTP5可以抑制Cdk5的过度活性,恢复胰岛素分泌,在2型糖尿病治疗中可能有潜在的广阔前景.     

Cdk5和TGF-β1在糖尿病肾病足细胞中的表达及其作用

目的应用糖尿病肾病模型,观察周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk5)和转化生长因子-β1(TGF-β1)在糖尿病肾病足细胞中的表达及其在足细胞损伤中的作用。方法分实验组和对照组2组,实验组,应用13周db/db小鼠作为糖尿病肾病小鼠模型;对照组,应用13周C57BL/6J小鼠作为正常对照模型。相同条件下喂养小鼠,1周后处死,取小鼠肾脏组织切片,免疫组化染色方法测定小鼠足细胞中TGF-β1、Cdk5及肿瘤蛋白-1(WT1)的表达,并进行统计学分析。结果实验组(db/db小鼠)足细胞中Cdk5表达水平(0.30±0.03)较对照组(0.27±0.25)明显升高(P<0.05);TGF-β1表达水平(0.26±0.03)较对照组(0.23±0.02)明显升高(P<0.05);足细胞特异性标志物WT1表达水平实验组(0.23±0.12)较对照组(0.26±0.02)明显降低(P<0.05)。结论糖尿病肾病小鼠足细胞中Cdk5和TGF-β1表达增多,可能是导致足细胞数量减少的原因,说明Cdk5、TGF-β1与足细胞凋亡机制密切相关。     

周期素依赖性蛋白激酶5过度活性与肾小球足细胞凋亡的关系研究

目的 通过在肾小球足细胞中转染p25基因,探讨周期素依赖性蛋白激酶5（Cdk5）的活性对足细胞结构及功能的影响。方法 2014年度,于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养分化成熟的小鼠离体足细胞,将足细胞分为对照组、空转染组和p25转染组。应用pAdTrack-CMV病毒载体克隆p25基因,并转染足细胞,48 h收集细胞;采用Western blotting法测定Cdk5、p25、p35及细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3的表达水平;应用免疫沉淀和同位素γ-32P标记法测定Cdk5活性;足细胞免疫荧光化学染色,观察Cdk5、p35在足细胞中的表达,以及足细胞Actin的排列情况。结果 HEK293细胞Cdk5表达阳性,p35表达阴性,肾脏皮质、足细胞和肾小球中均有不同程度的Cdk5和p35的表达。对照组和空转染组p25表达阴性,p25转染组p25表达阳性。各组细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3表达水平和Cdk5活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中p25转染组细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3表达水平和Cdk5活性高于对照组和空转染组（P＜0.05）。p25转染组足细胞内Actin排列紊乱,细胞形态发生异常改变,对照组和空转染组细胞内Actin排列正常,细胞形态没有发生改变。结论 p25引起Cdk5过度活性可致肾小球足细胞形态改变,Actin排列紊乱,诱发细胞凋亡。因此,Cdk5的活性在维持足细胞正常结构和功能方面发挥重要作用。