阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因的真核表达载体。方法Trizol试剂提取阴道毛滴虫株基因组总RNA,RT-PCR扩增粘附蛋白65-3基因,定向克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定正确的重组质粒pMD-18T-ap65-3和peDNA3．1（．＋）空质粒径BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切后,凝胶电泳纯化回收目的片段,将粘附蛋白65-3基因亚克隆入peDNA3．1（＋）载体并进行筛选和鉴定。结果成功克隆出阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因,序列分析发现该基因的开放阅读框长为1704bp,与GenBank上公布的粘附蛋白65-3基因序列比较,同源性高达99．6％,经PCR鉴定,限制性酶切鉴定及测序鉴定,正确构建出重组质粒peDNA3．1-ap65-3。结论成功克隆出粘附蛋白65-3基因并构建出真核表达质粒pcDNA3．1-ap65-3,为进一步研究该基因的功能及滴虫的致病机制奠定实验基础。     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因真核表达质粒的构建

作者用螯合树脂(Chelex-100)提取阴道毛滴虫基因组DNA,PCR扩增出阴道毛滴虫铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因,克隆入pMD-18T载体,亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒。经PCR及酶切鉴定,Fd基因体外扩增产物为306bp,与已知序列吻合。成功构建了Fd基因的真核表达质粒。     

阴道毛滴虫AK基因原核表达质粒的构建及在大肠埃希菌中的表达

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kinase,以下简称AK)基因原核表达质粒并予以表达.方法 AK DNA的克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AKDNA片段,T4连接酶连接到含有2个酶切位点的原核表达载体PUC18,构建出重组原核表达质粒PUC18-AK,经PCR、酶切鉴定.重组质粒PUC18-AK经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在大肠埃希菌中进行初步表达.结果 AK基因体外扩增产物大小均为690 bp,重组原核表达质粒经PCR及酶切鉴定表明获得正确重组子.在大肠埃希菌中表达出AK蛋白,经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析与理论预测值相符.经蛋白质印迹法(westerm blotting)鉴定具有免疫原性.结论 成功地构建了AK基因原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达了AK蛋白.     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫黏附蛋白33基因(adhesionprotein33gene,ap33gene)真核表达载体。方法提取阴道毛滴虫分离株基因组DNA,PCR扩增黏附蛋白33基因,克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定出的重组质粒pMD-18T-ap33和pcDNA3.1( )空质粒经BamHⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,凝胶电泳后回收ap33目的基因和pcDNA3.1( )空质粒酶切片段,将ap33基因亚克隆入pcDNA3.1( )载体并进行筛选和鉴定。结果PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白33基因,重组质粒pMD-18T-ap33经双酶切,PCR及序列分析,ap33基因的长度为930bp,与GenBank上公布的ap33基因序列同源性达99%。经凝胶电泳、PCR鉴定和限制性酶切鉴定,构建出pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。结论成功构建了阴道毛滴虫pMD-18T-ap33克隆质粒及pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。     

米索前列醇致晚孕子宫破裂

1　病历摘要患者 2 9岁 ,孕 4产 21 ,末次月经 1999年 4月 17日 ,预产期 2 0 0 0年 1月 2 4日。因停经 37 3周、反复引产失败、腹膜炎于2 0 0 0年 1月 1日转入我院。入院前 8天 ,B超诊断臀位、胎儿脑积水伴脊柱裂 ,在当地医院行羊膜腔内利凡诺引产 ,剂量不详 ,2天后因无宫缩口服米索前列醇 6 0 0 μg,服药后半小时开始宫缩并逐渐加重 ,10 h以后 ,因病人难以忍受 ,腹壁注射药物一剂 ,药名和剂量不详 ,宫缩逐渐缓解到消失。次日行缩宫素引产 ,腹痛加剧停止引产 ,于当晚再次口服米索前列醇 6 0 0 μg,病人感腹部持续剧烈腹痛 ,阵发性加剧 ,…     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kimse,AK)基因真核表达载体并予以鉴定.方法 根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性.克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1( ),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1( )-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性.结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段.结论 成功地构建了基因真核表达载体.     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的克隆和序列分析

目的　构建阴道毛滴虫铁氧还蛋白 (ferredoxin ,Fd)基因重组质粒 ,并进行克隆及序列分析。　方法　根据Fd基因已知序列 ,设计合成 1对引物 ,应用螯合树脂 (Chelex-100 )提取基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增出Fd基因 ,克隆入pMD-18T载体 ,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞 ,经PCR及酶切鉴定、测序。　结果　Fd基因体外扩增产物长度为 306 bp ,重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子 ,测序结果表明其片段与已知序列吻合。　结论　克隆出阴道毛滴虫Fd基因。     

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因的cDNA克隆与序列分析

目的对阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因进行cDNA克隆与序列分析。方法Trizol试剂提取阴道毛滴虫基因组RNA。以总RNA为模板,RT-PCR扩增黏附蛋白65-3基因,定向克隆入pMD-18T线形载体,构建pMD-18T-ap65-3重组质粒,并进双行酶切﹑PCR鉴定及测序分析。结果RT-PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因。经凝胶电泳﹑PCR鉴定和限制酶切鉴定,成功的构建出pMD-18T-ap65-3重组质粒。序列分析表明,黏附蛋白65-3基因开放阅读框长为1 704 bp,与GenBank上公布的黏附蛋白65-3基因序列比较,其同源性高达99.6%。结论阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因体外扩增及测序的成功,为进一步研究阴道毛滴虫的致病机理及滴虫病防治方法奠定了基础。