酵母三杂交技术的应用策略及在病毒研究中的应用

从酵母双杂交系统衍生出来的酵母三杂交系统是一种主要用于研究细胞内RNA-蛋白质相互作用强大的技术方法,也为病毒相关研究,尤其为研究病毒生活史中病毒RNA与病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用提供了新的工具。本文重点介绍了此种形式的酵母三杂交系统的原理、缺陷、应用和应用策略。另外,本文还介绍了同时发展起来的另外两种形式的酵母三杂交系统,即分别用于研究小分子配体-受体相互作用、复杂蛋白质相互作用的酵母三杂交系统。     

SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶的原核和真核表达

目的:在大肠杆菌中表达和纯化重组RDRP蛋白,观察RDRP蛋白在293细胞中的表达及亚细胞定位.方法:构建原核表达质粒pGEX-4T-1-RDRP,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白.构建真核表达载体pCMV-myc-RDRP瞬时转染293细胞,转染48 h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位以及Western Blotting检测.结果:成功构建了表达RDRP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到分子量约为121 kDa的融合蛋白.RDRP蛋白在293细胞中高效表达,主要分布在细胞质.结论:获得了重组GST-RDRP融合蛋白,为进一步探讨RDRP的功能奠定基础,在真核细胞中过表达的RDRP蛋白主要定位在细胞质.     

人细胞因子受体样因子3在真核及原核细胞中的表达

目的:观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位,并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白.方法:将真核表达载体pCMV-myc-CRLF3瞬时转染293T细胞,转染24 h和48 h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位;构建原核表达质粒pGEX-4T-1-CRLF3,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白.结果:CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达,主要分布在细胞质和细胞膜;成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到Mr约为74 000的融合蛋白.结论:在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜;获得了重组GST-CRLF3融合蛋白,为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础.     

酵母三杂交技术的应用策略及在病毒研究中的应用

从酵母双杂交系统衍生出来的酵母三杂交系统是一种主要用于研究细胞内RNA-蛋白质相互作用强大的技术方法,也为病毒相关研究,尤其为研究病毒生活史中病毒RNA与病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用提供了新的工具。本文重点介绍了此种形式的酵母三杂交系统的原理、缺陷、应用和应用策略。另外,本文还介绍了同时发展起来的另外两种形式的酵母三杂交系统,即分别用于研究小分子配体-受体相互作用、复杂蛋白质相互作用的酵母三杂交系统。     

表达Cre酶复制缺陷型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建Cre-loxP条件性基因敲除系统中Cre酶的重组腺病毒表达载体,作为体细胞条件性基因敲除的基础,并为传统ES细胞条件性基因敲除提供新的选择。方法用pAd-easy系统在大肠杆菌内经同源重组的方法构建Cre酶的复制缺陷型重组腺病毒载体;W estern b lot方法鉴定Cre蛋白的表达。结果在大肠杆菌内构建出重组腺病毒质粒,在包装细胞系内包装出重组病毒颗粒;测定病毒滴度为106pfu/L;重组病毒在细胞内表达Cre蛋白。结论表达Cre酶的重组腺病毒载体构建成功,阳性重组质粒的鉴定方法得以改进,为进一步的体细胞Cre-loxP条件性基因敲除提供了基础。     

中医“芳香辟秽”理论指导下芳香精油在农业生态种植中的应用潜力

为防治病虫害的高发,实现农业种植中作物的高产,大量化学农药的施用已成常规,由此造成严重的土壤环境污染、农药残留和不可预估的栽培作物品质和商品价值的降低。在人们日益关注食品安全和环境保护的当今时代,从自然界中寻求具有较强天然抗菌活性、低毒和较低环境不良反应的天然产物对于作物病害管理至关重要。如何高效寻找此类物质,研究其对病原菌的作用机制,并将之应用于农业种植领域是研究的重点。芳香药物自古就被认为具有"辟秽""除恶"作用,芳香所辟之"秽"是各种无形、有形之秽,芳香辟秽理论在医学方面针对抗病原微生物实际应用历史悠久。那么,该理论在农用微生物上是否依然奏效?挥发油,又称为芳香精油,是具有芳香气味的植物次生代谢产物。鉴于挥发油中具有复杂多样的对多种致病菌有抑菌活性的化学物质,在自然界中能降解成为非毒性物质,因此对环境保护及农业生态系统可持续发展更为有利,故提出"芳香辟秽"理论指导下的中医农业发展理念,并结合前期研究,对不同来源植物的挥发油及其主要活性成分、作用机制及在农业生态系统中的应用进行总结,以期使挥发油真正为农业生态种植保驾护航。