解脲支原体DNA检测室内质控物的制备及质控方案的设计

目的制备解脲支原体(UU)DNA荧光定量PCR室内质控物,建立室内质量控制体系,对其临床应用进行初步评价。方法分别留取Ct值为24~25(阳性)和32~33(弱阳性)标本和检测结果为阴性的标本,待留取到15mL时充分混匀,按每管150μL分装作为室内质控物。前20次检测采用"即刻法"判断检测结果是否在质控范围内,20次以后绘制Levey-Jennings图,确定靶值、标准差(s)和变异系数(CV),采用Westdard多规则质控方法对自制室内质控物检测结果进行判断。在Unity Real Time(URT)系统中使用质控规则配置操作导出UU-DNA的功效函数图(OPSPecs图),根据OPSPecs图设置质控规则。结果131次实验中,前20次采用"即刻法"判断室内质控物;20次以后采用Levey-Jennings图判断,质控品稳定,质控规则合理。结论用临床分泌物混合液制备UU-DNA检测项目的室内质控物品,制备方法简单,测定结果稳定,可作为实验室检测UU-DNA项目的质控品;依据OPSPecs图设置分子生物学检测项目的室内质控规则简便、实用。     

荧光PCR检测CYP2C19基因分型分析性能验证程序研究

目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)检测CYP2C19基因分型分析性能验证程序。方法依据《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》对荧光PCR方法检测CYP2C19基因分型进行准确性、精密度、灵敏度、特异度、临界值和最低检测限等的相关性能验证。结果荧光PCR与测序法检测CYP2C19基因分型结果符合率为100%;荧光PCR检测CYP2C19基因分型精密度用CV表示,2G、2A、3G和3A反应体系FAM和ROX荧光通道结果CV均小于10%;以测序法结果为标准,诊断灵敏度和特异度结果均为100%;验证cut off值2G反应体系△Ct为0.95,2A反应体系△Ct为0.84,均小于设定的cut off值5;验证的cut off值3G反应体系△Ct为1.47,3A反应体系△Ct为1.43,均小于设定的cut off值7;最低检测限为10ng/μL。结论荧光PCR检测CYP2C19基因分型各项性能验证指标符合要求,可以在实验室内开展。     

血性宫颈脱落细胞标本对HPV核酸分型检测结果影响的研究

目的探讨血性宫颈脱落细胞标本对流式荧光杂交法人乳头瘤病毒(HPV)DNA分型检测结果的影响。方法根据血红蛋白(Hb)水平,将宫颈脱落细胞标本分为5组,A组Hb为0g/L(10例),B组为0g/LHb≤30g/L(10例),C组为30g/LHb≤60g/L(20例),D组为60g/LHb≤100g/L(20例),E组为Hb100g/L(20例);每组标本中50%初检结果为阳性,50%初检结果为阴性。每例标本分别取样50、100、200、500、1 000μL进行检测,分析检测结果。结果初检结果为阴性的标本、A组5例初检结果阳性标本、B组5例初检结果阳性标本,不同取样量检测结果一致。C、D、E组各10例初检结果阳性标本中,分别有4例、4例和9例标本,在不同取样量检测时,出现HPV亚型漏检。结论血性宫颈脱落细胞标本有可能导致流式荧光杂交法HPV分型检测假阴性结果;有必要根据标本Hb水平,制定合适的取样量标准,以保证检测结果准确性。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA假阴性结果原因分析

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus, HBV-DNA)产生假阴性结果的原因,以控制和减少假阴性结果。 方法依据第三版《临床检验操作规程》和2013版中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)-CL36《医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》,对当天送检的79份HBV DNA定量项目出现HBV-DNA假阴性的临床标本进行复查,并通过试验研究对试剂、仪器、操作过程和环境等原因分别进行确认。首先,分析2015年5月13日检测的79份临床送检的HBV-DNA定量检测血清标本和质控品的仪器原始结果,排除试剂、仪器和人员问题;其次,5次重复实验验证HBV-DNA定量结果为10⁷ IU/ml的临床血清样本是否因主要操作步骤不规范导致HBV-DNA定量检测结果下降(偏倚>7.5%)。选择第一次检测结果在6次方以上的血清标本2份,平行做5个复孔,其中1份标本做5个复孔,即用取上清液时所弃沉淀分别以不弃掉沉淀、弃掉1/4沉淀、2/4沉淀、3/4沉淀和全部沉淀分为A0、A1、A2、A3、A4组,比较弃上清液中沉淀量对HBV DNA定量检测结果的影响。另1份标本5个复孔在加模板量时,以正常加2 μl为对照组A0,其他4孔分别加1.5、1、0.5、0.1 μl模板为A1、A2、A3、A4组,分析模板加样量的不同对HBV DNA定量检测结果的影响;第三,挑选第一次HBV DNA定量检测结果为不同次方的10份血清标本,其中5份分别加入1 μl除胶剂,另5份分别加入1 μl含氯消毒液,验证是否因除胶剂或含氯消毒液导致HBV-DNA定量检测出现假阴性结果(偏倚>7.5%)。 结果操作过程中弃上清液时,A1~A4组与A0比较,各孔的偏倚均<7.5%,无差异。加入不同量的模板,A1和A2与A0比较,无差异(偏倚均<7.5%),随着模板加入HBV DNA量的减少,A3和A4孔HBV DNA值逐渐降低,偏倚均>7.5%。加入商用除胶剂1 μl后的检测结果与初次检测结果比较,5份标本中,有3份标本检测结果偏倚>7.5%。加入含氯消毒液1 μl后的检测结果与初次检测结果比较,5份标本中有3份标本检测结果偏倚>7.5%,其中有1份标本结果由阳性(10⁷ IU/ml)变为阴性。 结论除胶剂和次氯酸气溶胶对荧光定量PCR的DNA模板扩增环节的抑制作用是产生荧光定量PCR检测HBV-DNA假阴性的主要原因,临床基因实验室应当注意使用除胶剂和次氯酸消毒液后通风与降低次氯酸在空气中浓度过高问题。