杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。     

与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的新蛋白的酵母双杂交筛选

目的:用酵母双杂交的方法筛选与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基(FLA8)C端相互作用的蛋白。方法:设计特异性引物(上下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点),扩增FLA8C端(433个氨基酸)cDNA,与穿梭载体pGBKT7连接以构建诱饵表达载体,然后转化酵母菌株Y187和AH109,Westernblot法检测诱饵蛋白在转化酵母菌株内的表达。通过自激活实验和毒性实验检测诱饵表达载体是否适合利用酵母双杂交的方法筛选相互作用蛋白。转化诱饵质粒的酵母菌株Y187与AH109(文库菌)杂交,待三叶形合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序。结果:成功构建了pGBKT7-FLA8-C双杂交诱饵载体;经检测该载体的表达产物对Y187和AH109均无自激活和毒性作用,可用于酵母双杂交实验;杂交后筛选得到2个阳性克隆,测序结果显示为鞭毛结合蛋白107(FAP107)和含蛋白结合结构域的预测蛋白。结论:成功筛选得到了与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的蛋白,分别为FAP107和预测蛋白。     

再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK 293T细胞中的表达、纯化

目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV (regenerating islet-derived protein IV, Reg IV)。方法 根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞（实验组）,同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）与免疫印迹试验（Western-Blot,WB）检测Reg IV蛋白表达水...     

金标法检测尿β2-MG在肾功能损伤诊断中的临床价值

目的评价尿液β_2-微球蛋白(β_2-MG)金标检测试剂盒在肾功能早期损伤诊断中的应用价值。方法将临床诊断为肾病综合征患者53例、慢性肾炎综合征患者40例、慢性肾衰竭患者18例、高血压肾病患者33例、糖尿病肾病患者23例作为研究组,体检健康者157例作为对照组,以β_2-MG金标检测试剂盒检测β_2-MG水平,并与胶乳增强免疫比浊法检测结果进行比较。结果金标法与胶乳增强免疫比浊法检测尿液β_2-MG阳性率比较,差异无统计学意义(P0.05);金标法检测临床确诊肾病的167例患者尿β_2-MG的灵敏度为76.7%,符合度为85.2%,特异度为94.3%。结论尿液β_2-MG金标检测试剂盒对诊断肾功能早期损伤具有一定的临床应用价值。     

2019—2022年上饶市食品从业人员携带诺如病毒状况调查

目的 分析2019—2022年上饶市食品从业人员诺如病毒携带状况,为防控诺如病毒疫情提供依据。方法 于2019—2022年在上饶市2个县（区）的88家餐饮服务单位、10家食品加工企业和2所高校中选择无腹泻症状身体健康的食品从业人员为研究对象,采集粪便样本,采用实时荧光定量聚合酶联反应方法检测诺如病毒及其型别。结果 共调查食品从业人员1 006人,检出诺如病毒核酸阳性样本13份,阳性率为1.29%,其中型别以GⅡ.4型为主,占76.92%。不同年份的粪便诺如病毒检出阳性率差异有统计学意义（Fisher P<0.05）;第一季度采集样本检出阳性率比第三季度高（P<0.05）;不同年龄段、性别和工种的食品从业人员的诺如病毒检出阳性率差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论 上饶市食品从业人员诺如病毒隐性感染率相对较低,但该病毒易通过食品传播,需加强食品从业人员诺如病毒感染监测,防控诺如病毒疫情暴发。     

杜氏盐藻鞭毛相关蛋白cDNA片段的克隆及在鞭毛重吸收过程中的表达

目的:克隆杜氏盐藻鞭毛相关蛋白(FAP)的cDNA片段并探讨其功能.方法:分析莱茵衣藻等生物的FAP同源蛋白的氨基酸序列保守区域,设计简并引物.提取盐藻总RNA进行RT-PCR.根据得到的序列设计3'RACE引物,巢式PCR扩增该cDNA的3'端序列.秋水仙碱处理对数生长期的盐藻细胞,使细胞停留在分裂中期,并诱导鞭毛缩...     

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析

目的：探讨杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)基因在鞭毛再生中的作用。方法：通过设计简并引物及RACE法克隆了杜氏盐藻SAHase基因全长,使用pH休克法对杜氏盐藻进行鞭毛去除及再生,通过实时荧光定量PCR研究在转录水平上SAHase基因的变化。结果：所克隆的杜氏盐藻SAHase基因cDNA全长1 926 b...