毛囊干细胞的研究及应用进展

大面积深度烧伤后自体皮缺乏,如何以有限的自体皮永久覆盖创面是临床上的难题.对于严重创伤和重度烧伤引起的皮肤缺损,较常见和有效的方法是利用自体断层皮片移植,但存在供皮量有限和造成额外损伤等问题.皮肤组织是重要的干细胞库,其中毛囊干细胞不仅有巨大的增殖潜能,而且能多向分化,是皮肤组织修复细胞的重要来源.     

外源性P物质对糖尿病大鼠烫伤创面组织愈合及新生血管化的影响

目的 研究外源性P物质（SP）对烫伤创面组织愈合及新生血管化的影响。方法 84只Wistar大鼠经腹腔一次性注射链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型后,于背部制备直径2 cm的深Ⅱ度烫伤创面。根据创面不同处理方式将大鼠随机分为实验组（局部注射SP）和对照组（局部注射与实验组等量的磷酸缓冲液）,每组42只。分别于创面形成后当日和第1、3、7、10、14、21 天,观察创面并计算创面愈合率;免疫组织化学染色观察创面组织中新生血管内皮细胞表面标志物CD31表达,计算微血管密度。结果 创面形成后第7天,实验组创面愈合率明显高于对照组,为（42.69±3.26）% vs（30.24±1.17）%（P<0.01）。免疫组织化学检测发现,自创面形成后第7天起,实验组创面组织中CD31表达及微血管密度均明显高于对照组（P<0.01）。结论 外源性SP具有促进糖尿病烫伤创面愈合作用,其机制可能与上调创面组织中CD31表达,使新生血管再生加速有关。     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植＋干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植＋干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P〈0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。     

糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中神经肽P物质的表达

目的 研究糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面中神经肽P物质(SP)表达及变化规律.方法 84只Wistar大鼠,随机分为糖尿病组和对照组,每组42只.糖尿病组腹腔内一次性注射链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型,对照组给予同等剂量的无菌柠檬酸缓冲液腹腔注射.所有大鼠麻醉后背部制成直径2 cm的深Ⅱ度烫伤创面.分别于烫伤前及烫伤后的不同时相采集创面组织标本,测算创面愈合率,免疫组化染色分析创面SP染色阳性区域面积,ELISA法创面组织中SP表达变化.结果 烫伤后第7天起,糖尿病组各时相点的创面愈合率均显著低于对照组(P<0.01).糖尿病组各时相点创面SP染色阳性区域面积均显著低于对照组,其中以烫伤后7 d时尤为显著,为(1 350.93±99.28)μm2 vs(1 715.86±103.41)μm2(P<0.01);糖尿病组各时相创面组织中SP表达均明显低于对照组,其中以烫伤后7 d时最为显著,为(114.04±9.96)vs(143.39±8.94)(P<0.01).结论 糖尿病大鼠创面组织中SP表达明显减少,可能是其创面难愈的原因之一.     

外源性P物质对糖尿病大鼠烫伤创面组织愈合及新生血管化的影响

目的 研究外源性P物质(SP)对烫伤创面组织愈合及新生血管化的影响.方法 84只Wistar大鼠经腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型后,于背部制备直径2 cm的深Ⅱ度烫伤创面.根据创面不同处理方式将大鼠随机分为实验组(局部注射SP)和对照组(局部注射与实验组等量的磷酸缓冲液),每组42只.分别于创面形成后当日和第1、3、7、10、14、21 天,观察创面并计算创面愈合率;免疫组织化学染色观察创面组织中新生血管内皮细胞表面标志物CD31表达,计算微血管密度.结果 创面形成后第7天,实验组创面愈合率明显高于对照组,为(42.69±3.26)% vs(30.24±1.17)%(P<0.01).免疫组织化学检测发现,自创面形成后第7天起,实验组创面组织中CD31表达及微血管密度均明显高于对照组(P<0.01).结论 外源性SP具有促进糖尿病烫伤创面愈合作用,其机制可能与上调创面组织中CD31表达,使新生血管再生加速有关.     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的 利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法 体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植+干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果 去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植+干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P<0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论 去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中神经肽P物质的表达

目的研究糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面中神经肽P物质（SP）表达及变化规律。方法84只Wistar大鼠,随机分为糖尿病组和对照组,每组42只。糖尿病组腹腔内一次性注射链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型,对照组给予同等剂量的无菌柠檬酸缓冲液腹腔注射。所有大鼠麻醉后背部制成直径2cm的深Ⅱ度烫伤创面。分别于烫伤前及烫伤后的不同时相采集创面组织标本,测算创面愈合率,免疫组化染色分析创面SP染色阳性区域面积,ELISA法创面组织中SP表达变化。结果烫伤后第7天起,糖尿病组各时相点的创面愈合率均显著低于对照组（P〈0．01）。糖尿病组各时相点创面SP染色阳性区域面积均显著低于对照组,其中以烫伤后7d时尤为显著,为（1350．93&#177;99．28）μm^2vs（1715．86&#177;103．41）μm^2（P〈0．01）;糖尿病组各时相创面组织中SP表达均明显低于对照组,其中以烫伤后7d时最为显著,为（114．04&#177;9．96）vs（143．39&#177;8．94）（P〈0．01）。结论糖尿病大鼠创面组织中SP表达明显减少,可能是其创面难愈的原因之一。     

不同冻存-解冻法处理小鼠皮肤组织对毛囊干细胞生长的影响

目的 观察皮肤组织经不同冻存-解冻法处理后,分离的毛囊干细胞的生长状况,寻找较好的组织冻存方案,为解决无法短期收集足量标本而不能有效获取毛囊干细胞的问题提供实验方法参考.方法 获取大鼠有两撮触须的上唇,经不同方法处理后,分离毛囊隆突部细胞.设立对照组:新鲜标本;实验组1:未加冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组2:4℃保存24 h;实验组3:1.4 moL/L.乙二醇作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组4:1.4 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组5:1.4 tool/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存3个月;实验组6:0.7 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;冻存各组降温速率为0.5℃/min.其中3～6组分别采用单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法做对比.比较经以上6种方法处理后分离的毛囊隆突部细胞的活力和贴壁、增殖情况.结果 经冻存+单用培养基漂洗快速复苏法,4℃处理组获得的平均细胞活力为90.38%±4.62%,明显高于其他处理组(P值均＜0.05),仅次于对照组94.00%±5.64%.1.4moL/L DMSO作为冻存保护剂无论冻存24h或3个月均可取得较高的细胞活力(56.00%±3.91%和47.25%±3.55%),明显高于其他处理组(P值均＜0.05).组3～组6经单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法复苏所得平均细胞活力分别是25.63%±2.32%和27.25%±2.56%、56.00%±3.51%和54.88%±4.03%、47.25%±3.01%和44.00%±2.98%、27.88%±2.20%和26.75%±2.26%,差异均不显著(P值均＞0.05).各组毛囊干细胞生物学特性(贴壁、增殖等能力)与细胞活力呈相关趋势.结论 皮肤组织在4℃条件短期内可保持原代培养细胞的活力;皮肤组织以1.4 M DMSO为冻存剂-70℃条件下保存可较长时间保持细胞活力,较适合小鼠皮肤组织的保存,为毛囊干细胞的进一步研究提供技术支持.