高效转染体外转录合成的CTGF-siRNA至硬皮病皮肤成纤维细胞

目的研究CTGF—SiRNA的体外转录合成及使用专门转染试剂盒将其转染至硬皮病皮肤成纤维细胞的转染效率，为将RNA干扰技术深入应用到硬皮病治疗做铺垫。方法体外培养硬皮病皮肤成纤雏细胞；设计CTGF的siRNA；通过体外转录获得siRNA；将siRNA以SilencerTTM siRNA Labeling Kit标记；用siPORT^TM Amine转染至成纤维细胞；荧光显微镜观察转染情况。结果转染率可高达85．32％。结论该方法操作简便．且可达到理想的转染率。     

RNA干扰对系统性硬化病皮肤成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 研究RNA干扰对系统性硬化病(SS)皮肤成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA和蛋白表达水平的影响.方法 设计4个针对CTGF的特异性小干扰RNA(siRNA)及一个非特异性siRNA.体外转录获得siRNA,将siRNA用6-羧基荧光素(FAM)标记后瞬时转染至原代培养的SS患者皮肤成纤维细胞;转染48h后,以RT-PCR及蛋白印迹法分别检测CTGF mRNA及蛋白量的变化.结果 转染了4个特异性siRNA的成纤维细胞中CTGF mRNA水平均有不同程度下调(P<0.001),抑制效果由强至弱为,siRNA742>siRNA828>siRNA578>siRNA948.蛋白印迹则显示有3个siRNA能使CTGF蛋白表达水平不同程度下调(P<0.001),其中siRNA742的抑制效应最强.结论 RNA干扰能显著抑制SS成纤维细胞CTGF的表达.     

综合医院组织细胞库信息系统的建立及意义

目的 通过对冻存标本管理系统的专业性、实用性和服务性等的概括,阐述了大型综合医院建立科研组织标本和细胞株信息资源系统的必要性.方法 开发"细胞冻存标本管理系统V2.2.1"软件,以win9x、winME、Win2000、WinXP为操作平台,对冻存标本进行信息管理.结果 该系统具有信息录入浏览、检索、以及数据维护、链接、管理等功能,具有效率高、操作方便等优点.结论 系统可准确、动态地反映储存库中的标本信息,从而大大提高和保证了对库存标本的管理效率和质量.     

5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响

目的：研究DNA低甲基化对穿孔素基因mRNA和蛋白表达的影响。方法：密度梯度离心分离正常成人的外周血淋巴细胞，磁珠分离CD4和CD8细胞后进行细胞培养，DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷（5-azaC）处理。分别提取DNA、RNA和蛋白质。亚硫酸氢钠处理DNA，巢式PCR进行扩增、转化入大肠杆菌，挑取克隆测序。实时定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测穿孔素mRNA的表达，Western印迹检测穿孔素蛋白量的变化。结果：5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞穿孔素mRNA和蛋白表达显著高于未处理的CD4和CD8细胞组（P〈0．05）。测序结果显示5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞DNA穿孔素启动子区域的甲基化水平降低，与未处理的CD4和CD8细胞组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：5-azaC处理后CD4和CD8细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的表达都有显著的增高，这种增高与CD4和CD8细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关。     

综合医院科研公共平台的建设与发展思路的思考

医院医学实验中心是全院的科研公用平台和教学基地之一。主要为研究生教学和全院科研人员提供生物技术培训、实验指导、仪器设备的使用和提供试剂以及实验消耗品等，并为全院的科研教学和研究生教育服务；以做到经济与效益并举、资源与利益共享的目的。结合实际工作对如何才能真正做到建设发展好和管理好做了一些思考。     

两种核酸染料的应用比较研究

目的 研究GoldView核酸染料对于凝胶中DNA/RNA的染色效果及其取代EtBr用于常规电泳后凝胶中核酸染色的可能性。方法 将电泳后的SSCP凝胶和琼脂糖凝胶放入两种核酸染液中轻摇浸染30～45min，并注意避光，300nm紫外灯下观察并照相记录。结果 GoldView染色后，dsDNA呈绿色荧光，ssDNA呈红色荧光，可检测到少至5ng的dsDNA，灵敏度与EtBr大致相当。结论 GoldView是一种安全、灵敏的EtBr替代品，可用于常规核酸染色。     

SLE患者T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化状态的探索

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域DNA甲基化状态及其在发病机制中的作用.方法 分离9例活动期SLE患者和7例正常人对照外周血CD4⁺与CD8⁺T细胞,并分别提取DNA.采用亚硫酸氢钠-测序法对CD4⁺与CD8⁺T细胞穿孔素基因启动子区域DNA甲基化水平进行检测.结果 在穿孔素基因启动子区域,正常对照组CD4⁺T细胞平均甲基化水平显著高于CD8⁺T细胞(P<0.05).活动期SLE患者CD4⁺T细胞平均甲基化水平显著低于正常对照组(P<0.05),而CD8⁺T细胞与正常对照组的差异则无统计学意义(P>0.05).结论 活动期SLE患者的CD4⁺T淋巴细胞的穿孔素基因启动子区域处于低甲基化状态.     

穿孔素基因启动子的克隆及体外区域性高甲基化

目的 克隆穿孔素基因启动子区域(PRF1),并对PRF1进行体外区域性高甲基化,为探讨穿孔素基因调控序列高甲基化能否引起穿孔素表达下调奠定基础.方法 PCR扩增穿孔素基因启动子区域(PRF1)后,先将PRF1克隆到T载体,再定向亚克隆至报告基因栽体;然后对PRF1片段进行体外区域性高甲基化.结果 (1)克隆PRF1到报告基因载体pGL3-Basic后双酶切及测序鉴定结果正确.(2)对PRF1片段进行体外区域性高甲基化后鉴定显示PRF1片段区域性高甲基化完全.结论 成功克隆PRF1至报告基因载体pGL3-Basic并对PRF1片段进行体外区域性高甲基化,为今后研究奠定了基础.     

SLE患者T淋巴细胞穿孔素mRNA及其蛋白的表达

为了解系统性红斑狼疮(SLE)患者穿孔素mRNA及其蛋白表达水平,检测了活动期SLE患者的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞穿孔素mRNA及其蛋白表达水平.     

对临床实验室生物安全管理的建议

医学临床实验室生物安全是社会安全的一部分.本文简要介绍了医院临床实验室生物安全发展的现状,针对其特点阐述了常见的生物危害;结合国外相关的生物安全管理措施,就医院实验室的生物安全管理问题做了思考,并根据国家实验室安全管理的法律法规提出了加强临床实验室生物安伞管理的一些建议.