北京市昌平区某高校大学新生结核潜伏感染调查

目的 调查大学新生结核潜伏感染情况,以便采取预防性措施。 方法 2010年10月随机纳入北京市昌平区某高校入学新生TST≥10 mm的健康受试者420例,应用ELISPOT检测经抗原刺激后分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞(即斑点形成细胞,SFCs)数量,并对ELISPOT阳性者进行为期3年的结核感染发病情况监测。 结果 ELISPOT检测LTBI总的阳性率为41.2%,在BCG接种(阳性率41.5%)和未接种(阳性率40.0%)中差异无统计学意义(χ²=0.064, P=0.447),在TST直径10~14、15~19和≥20 mm组间(37.6%、45.4%和64.3%)差异有统计学意义(χ²=8.408, P=0.015),173例未治疗的 ELISPOT+/TST+者经3年的ATB监测,发病率为0。 结论 北京市昌平区某高校大学新生LTBI比率高,但仅以ELISPOT和TST双阳性者为预防性治疗指标,尚不足够。     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药相关基因的筛选及鉴定

目的筛选二线抗结核药物对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)的耐药相关基因。方法构建H37Rv转座子文库,筛选PAS耐药克隆,随机引物PCR扩增转座子插入突变基因。在PAS耐药菌株中鉴定耐药相关基因的突变情况。结果构建了较完整的H37Rv转座子文库,并筛选出201个PAS耐药克隆,经测序找到4个可能的PAS耐药相关基因,分别是Rv1534、pknF、ndh、papA1。papA1基因检测到一个无义突变,为papA1基因339位C→T点突变。结论酰基转移酶基因papA1可能为PAS耐药相关基因。     

复苏因子E-DNA疫苗对BALB/C小鼠免疫效应的研究

目的:探索复苏因子E(RpfE)-DNA疫苗的小鼠免疫效果.方法:利用真核表达栽体PCDNA3.1构建PCDNA3.1-RpfE重组质粒.将SPF级BALB/C小鼠随机分为5组,即空质粒组、RpfE质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组,于0、3、6周先后3次免疫小鼠,在第3次免疫后3周,心脏取血ELISA方法检测血清RpfE IgG抗体效价、干扰素γ(IFNγ)水平;并行脾淋巴细胞培养,以RpfE蛋白刺激淋巴细胞,CCK-8法检测淋巴细胞增殖指数、ELISA方法检测上清诱导IFNγ和白介素12(IL-12)产生水平,乳酸脱氢酶试验检测小鼠脾细胞毒性T淋巴(CTL)杀伤效应.结果:(1)RpfE质粒组小鼠血清中RpfE抗体水平明显高于其他各组(P<0.001);RpfE质粒组IFNγ水平明显高于空质粒组、生理盐水组、空白对照组和BCG组(P<0101或P<0.05).(2)RpfE质粒组具有较强的刺激淋巴细胞增殖作用,CCK-8实验表明其增殖指数高于其他各组(P<0.05);上清ELISA检测表明IFNγ和IL-12产生水平也高于其他各组(P<0.05).(3)RpfE质粒组脾淋巴细胞特异性CTL杀伤性与其他各组比较有统计学意义(P<0.05).结论:RpfE-DNA疫苗可诱导小鼠的免疫应答,具有良好的体液和细胞免疫原性.     

结核分枝杆菌复苏因子对结核性胸腔积液中结核分枝杆菌生长促进作用的探索

目的探讨结核分枝杆菌复苏因子（resuscitationpromotingfactor,Rpf）对结核性胸腔积液中病原菌生长的促进作用,以期提高临床标本体外培养阳性率,缩短培养时间。方法选择2012年10月至2013年10月期间北京胸科医院62例结核性胸膜炎患者,抽取胸腔积液经过离心处理后分别接种于改良罗氏培养基,以及含高、低浓度Rpf的MiddleBrook7H11固体培养基（简称“7H11培养基”）和生理盐水7H11培养基（生理盐水阴性对照组）中,每隔3d观察菌落形成情况,阳性者行抗酸染色（AFB）、PCR扩增试验及DNA测序进行菌种鉴定,观察比较高、低浓度Rpf对Mtb的促进生长作用。利用统计软件SPSS17．0进行统计学分析。Rpf培养组与改良罗氏培养组,以及Rpf培养组与生理盐水阴性对照组Mtb培养阳性率比较采用配对计数资料的x2检验;不同浓度Rpf培养组与生理盐水阴性对照组可视菌落平均时间（d）和阳性菌落数量比较采用配对样本t检验。以P〈0．05为差异有统计学意义。结果（1）结核性胸腔积液改良罗氏培养组中的Mtb培养阳性率为16．1％（10／62）,含Rpf的7H11培养基中的Mtb培养阳性率为43．5％（27／62）,两者比较差异具有统计学意义（x2=12．84,P〈0．01）;（2）含高、低浓度Rpf7H11培养基的可视菌落形成时间各为（20．92±0．58）d和（21．69±0．50）d,两组间差异无统计学意义（t=0．085,P〉0．05）,但显著快于生理盐水对照组（不含Rpf）的（38．08±0．94）d（t值分别为10．19、9．91,P值均GO．001）;（3）含高、低浓度Rpf的7H11培养基菌落形成单位数各为（34．12±4．06）×10^2和（37．27±5．63）×10^2,两组间差异无统计学意义（t=0．45,P〉0．05）,但显著多于生理盐水对照组（3．77±0．88）×10^2（t值分别为5．88、7．30,P值均〈0．001）。结论接种结核性胸腔积液后,含Rpf的7H11培养基较改良罗氏培养基可提高Mtb的培养阳性率,并缩短培养时间。     

11种结核分枝杆菌抗原皮肤试验反应效果评价

目的 评估11种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原用于MTB致敏后豚鼠皮肤试验反应的效果。方法 选取18只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级豚鼠(雌性,体质量250~300g),按接种剂量分为高(5μg)、中(0.5μg)、低(0.1μg)3组,每组6只。采用MTB标准株(H37Rv,ATCC27294)致敏豚鼠,致敏成功后豚鼠背部去毛皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)、重组结核杆菌融合蛋白(EC)和11种MTB抗原(包括重组抗原Rv3872、MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3117、Rv3120、Rv2346c、Rv3619c、Rv3425、Rv1738和Rv2626c),各0.1ml。分别于注射24h和48h后观察皮肤试验反应,测量硬结平均直径[(横径+纵径)/2],以硬结平均直径≥5mm为阳性。分析11种MTB抗原皮肤试验反应与TB-PPD 和EC的差异。结果 抗原注射24h后,剂量为5μg时Rv3120、Rv3619c的皮肤试验反应阳性率分别为9/9和8/9;剂量为0.5μg时EC、MPT64的皮肤试验反应均为阳性。TB-PPD(5IU)及EC(0.5μg剂量)、MPT64(0.5μg剂量)、Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)皮肤试验反应24h硬结平均直径[中位数(四分位数)]均大于反应48h[硬结平均直径分别为:9.00(7.00,11.00)mm 和6.50(5.50,8.25)mm、13.00(12.75,14.25)mm和9.00(8.00,9.75)mm、9.50(8.50,12.50)mm和8.50(5.50,9.50)mm、8.50(6.25,9.25)mm和5.00(0.00,5.50)mm、6.50(5.50,8.25)mm和3.50(1.50,4.75)mm],差异均有统计学意义(Z值分别为-2.494、-2.677、-2.207、-2.673、-2.670;P值分别为0.013、0.007、0.027、0.008、0.008)。皮肤试验反应24h时,MPT64(0.5μg剂量)、Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)与TB-PPD(5IU)硬结平均直径接近,差异均无统计学意义(H值分别为-0.496、0.819和1.714,P值分别为1.000、1.000和0.865);MPT64(0.5μg剂量)与EC(0.5μg剂量)皮肤试验反应情况接近,差异无统计学意义(H=2.288, P=0.221);Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)硬结平均直径均小于EC(0.5μg剂量),差异均有统计学意义(H值分别为3.795和4.690,P值分别为0.001和0.000)。 结论 MPT64(0.5μg剂量)和Rv3120(5μg剂量)的豚鼠皮肤试验效果相对较好,对于结核病诊断具有潜在应用价值。     

结核分枝杆菌Rv0808基因的克隆、表达、纯化及抗原性研究

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)体内诱导基因Rv0808,并制备多克隆抗体,研究其编码蛋白的抗原性,了解诊断应用价值。方法高保真PCR扩增Rv0808基因,克隆入表达载体pET-30a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3),测序正确的克隆用IPTG诱导表达。用镍柱纯化重组蛋白,然后用纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备和纯化多克隆抗体。将重组蛋白分别与多克隆抗体和结核病患者血清进行Western blot鉴定,并尝试用多克隆抗体进行免疫组化染色检测巨噬细胞中M.tb。结果成功构建了pET-30a(+):Rv0808重组表达载体。经过重组蛋白的可溶性表达及纯化后,SDS-PAGE结果显示在66kD处有一单一蛋白条带。将此蛋白免疫新西兰白兔后获得了效价为6400的多克隆抗体。重组蛋白与多克隆抗体可以发生免疫反应,但却不能检测出结核患者血清中的相应抗体。用此多克隆抗体也无法检测出巨噬细胞中的M.tb。结论结核分枝杆菌Rv0808编码蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,但可能对于结核病的诊断价值较小。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

目的 评价Mtb复苏因子DNA疫苗（resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA）对Mtb感染宿主的免疫保护作用。 方法 构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c小鼠（4周龄）分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染。检测血清复苏因子（Rpf）抗体、IFN-γ;RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验;检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2;对肺组织进行病理学检测和细菌负荷（CFU）计数。 结果 （1）疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平：Rpf D组0.32±0.1,Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01,空质粒组0.01±0.0,生理盐水组0.09±0.04,空白对照组0.03±0.01,RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D：45.6,43.2,45.1,45.7;Rpf E：51.6,53.6,51.0,52.2;P值均<0.01。血清IFN-γ：Rpf D组（43.9±24.8）pg/ml,Rpf E组（45.9±21.0）pg/ml,BCG组（21.0±11.0）pg/ml,空质粒组（7.9±4.9）pg/ml,生理盐水组（4.7±2.1）pg/ml,空白对照组（5.8±4.7）pg/ml,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组比较差异有统计学意义（F值分别为Rpf D：10.2;Rpf E：12.4;P值均<0.05）, 与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D：15.6,17.8,17.3;Rpf E：17.5,21.1,20.7;P值均<0.01。（2）淋巴细胞增殖实验CCK-8：Rpf D组176.0±4.2,Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1,空质粒组100.0±6.8,生理盐水组104.0±8.4,空白对照组116.0±2.2,RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：9.5,10.1,10.0,9.0;Rpf E：11.2,12.9,11.7,10.3;P值均<0.05。细胞杀伤实验：Rpf D组32.0±3.2,Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9,空质粒组3.3±1.5,生理盐水组6.7±0.5,空白对照组7.3±3.5,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：8.8,14.5,13.7,11.9;Rpf E：8.1,12.5,11.6,11.1;P值均<0.05。（3）Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测：IL-2：Rpf D组9.5±2.4,Rpf E组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1,空质粒组1.2±0.3,生理盐水组1.8±1.0,空白对照组1.5±0.7,Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：12.5,14.6,13.5,13.9;Rpf E：12.0,13.6,13.1,13.2;P值均<0.05。IFN-γ：Rpf D组22.2±5.7,Rpf E组28.7±14.4,BCG组16.1±10.1,空质粒组9.8±1.6,生理盐水组13.2±2.1,空白对照组15.7±2.9,RpfD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：7.8,12.6,8.7,8.3;Rpf E：11.3,16.4,14.7,14.2;P值均<0.05。 结论 实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫,有希望成为结核病候选疫苗之一。     

实时荧光定量PCR检测不同结核标本及其联合玻璃珠磨菌法检测价值的初步研究

目的: 探索实时荧光定量PCR(qRT-PCR)联合玻璃珠磨菌法对检测不同临床标本中结核分枝杆菌菌载量的优化作用。方法: 回顾性搜集2008年1月1日至2016年12月31日首都医科大学附属北京胸科医院住院和门诊诊治的疑似结核病患者11570份不同临床标本的qRT-PCR检测结果并进行分析,主要包括痰液1487份、脓液273份、脑脊液1391份、气管(支气管)肺泡灌洗液41份和血液4650份等。再通过建立伪随机函数的方法从中选取82份临床诊断为肺结核的痰液标本,对其进行玻璃珠(直径0.3mm)振荡磨菌前后qRT-PCR定量检测效果分析。结果: 11570份不同临床标本的总检测阳性率为12.16%(1407/11570)。其中,气管(支气管)灌洗液的检出率最高[36.59%(15/41)],以门诊患者来源的阳性率最高[43.48%(10/23)];其次是脓液标本[35.53%(97/273)],以住院患者来源的阳性率最高[36.26%(95/262)];痰液标本位居第三[30.33%(451/1487)];其他标本阳性率介于10.43%(485/4650)~15.03%(209/1391)之间。对选取的82份痰标本行5min的玻璃珠磨菌处理后,qRT-PCR检测的核酸浓度[44.45(9.05,71.62)×10⁷拷贝/ml]较处理前[4.03(1.87,5.92)×10⁷拷贝/ml]明显提高,差异有统计学意义(Z=2.120,P=0.016)。其中,有28份(34.15%)痰标本提高了菌株数量级,尤其是21份含菌量为10²拷贝/ml的临床痰标本经振荡研磨后有14份(66.67%)提升到了10³拷贝/ml菌量数量级,使阳性检出率由磨菌处理前的60.98%(50/82)提高到磨菌处理后的78.05%(64/82)。结论: qRT-PCR对灌洗液、脓液和痰液标本中结核分枝杆菌的检出率高,在其他标本中检出率低。采用玻璃珠振荡磨菌处理后可提高临床标本的阳性检出率。