慢性HBV感染者不同病程阶段HBV前S基因缺失突变的比较分析

目的 探讨慢性HBV感染者不同病程阶段前S(pre-S)基因缺失的临床流行特点及其临床意义. 方法 采用巢式PCR方法扩增测序146例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者(CHB组)、111例HBV相关肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者(LC组)、146例慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)患者(ACLF组)和136例HBV相关肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者(HCC组)的HBV pre-S基因(nt 2848-154).分析比较不同组pre-S基因缺失发生率、缺失热点区域和缺失片段长度. 结果 LC组和HCC组HBV pre-S基因缺失率显著高于CHB组(26.1%vs. 15.8%,P=0.040;34.6%vs. 15.8%,P<0.001);LC组pre-S1基因单独缺失率显著高于CHB组(17.1%vs. 4.8%,P=0.001);HCC组pre-S2基因单独缺失率显著高于CHB组(19.1%vs. 4.8%,P<0.001). 不同病程阶段患者发生缺失的热点区域也不相同,CHB组发生缺失的热点区域为nt 3031-3215(30.4%)和nt 24-57(30.4%);LC组为nt 2849-2866(55.2%)和nt 5-55(31.0%);ACLF组为nt 2849-2866(28.6%)和nt 1-54(25.7%);HCC组为nt 5-55(57.4%)和nt 2849-2866(12.8%).不同病程阶段患者发生pre-S基因缺失的片段长度差异无统计学意义. 结论 慢性HBV感染者中,随着疾病进展HBV pre-S基因缺失率呈上升趋势,其中pre-S1基因缺失突变在LC患者中显著增高,pre-S2基因缺失突变在HCC患者中显著增高.pre-S基因缺失可能参与驱动HBV慢性感染的疾病进展.     

多种肝脏疾病中隐匿性HBV感染检出率及其S基因MHR免疫逃逸相关突变特点分析

目的　分析多种肝脏疾病中隐匿性HBV感染（occult HBV infection, OBI）检出率,并探讨OBI患者HBV S基因主要亲水区（major hydrophilic region, MHR）免疫逃逸相关突变特点。方法　回顾性分析2005年1月—2017年12月就诊于中国人民解放军总医院第五医学中心的91 037例HBV感染住院患者临床资料,筛选出OBI患者并扩增其HBV S基因序列,分析其HBV S基因MHR免疫逃逸相关突变特点。结果　91 037例住院患者中OBI总检出率为0.53%（487/91 037）,急性乙型肝炎患者中OBI检出率最高（9.26%,130/1404）,肝硬化患者中OBI检出率最低（0.26%,78/29 921）。62例OBI患者组与124例非OBI患者组相比,OBI患者组MHR免疫逃逸相关突变总体检出率显著高于非OBI患者组（59.68% vs. 35.48%;P＜0.05）;OBI患者组MHR多个免疫逃逸相关突变的联合检出率显著高于非OBI患者组（43.55% vs. 22.58%;P＜0.05）;其中,sT118K、sK122R和sV168A 3种单点突变的检出率显著高于非OBI患者组。结论　本研究显示临床HBV感染患者中有较高的OBI检出率,而且不同肝脏疾病中OBI检出率不同。此外,HBV S基因MHR的免疫逃逸相关突变与临床实践中OBI的发生密切相关。     

乙型肝炎病毒核心启动子区核苷酸G1613A和C1653T变异的临床意义

目的 评价HBV G1613A和C1653T变异对乙型肝炎患者疾病进展、病毒体外复制力及核心启动子(CP)转录活性的影响.方法 共纳入258例研究对象,包括65例急性乙型肝炎(AHB)患者,120例慢性乙型肝炎(CHB)患者和73例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者.从患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增HBV DNA全长基因组,统计G1613A、C1653T和G1613A+C1653T变异的发生率.构建相应载体进行体外功能实验,观察病毒质粒转染HepG2细胞后对病毒复制力及其CP转录活性的影响.结果 258例患者中共检出B、C、D三种基因型,其检出率分别是22.2％、76.2％和1.6％.G1613A、C1653T及G1613A+C1653T变异发生率随疾病程度加重依次升高.AHB、CHB和ACLF患者上述3种变异的检出率分别为13.70％、31.80％和45.20％(P＜0.01),2.30％、16.30％和27.40％(P＜0.01),2.29％、12.07％和23.29％(P＜0.05).与野生株相比,G1613A变异株复制力升高6％,HBsAg降低15％,HBeAg表达呈阴性,CP转录活性降低16.2％;C1653T变异株复制力升高10％,HBsAg升高55％,HBeAg与野生株接近,CP转录活性升高17.1％;G1613A+C1653T变异株复制力升高7％,HBsAg升高66％,HBeAg升高227％,但对CP转录活性没有影响.结论 G1613A、C1653T在CP区的变异可增加HBV复制力,影响CP转录活性和HBV抗原的表达,G1613A+C1653T联合变异可能对这些功能产生协同作用,推测这三种变异与乙肝重症化发生机制相关.     

一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt1758-1777缺失突变新方法的建立

目的 建立一种新的单管巢式实时荧光PCR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV)样本核心启动子区nt1758-1777片段缺失突变.方法 通过比对分析GenBank收录的HBV基因序列,设计通用巢式PCR引物,建立优化方法体系;对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP区进行扩增,产物直接测序,并随机选择50例样本进行克隆测序,分析nt1758-1777缺失突变检出率.野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本,并对两种标准质粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增,获得熔解曲线及熔解温度,得到熔解曲线的阳性标准.用新建立的方法对340份样本进行检测,并用焦磷酸测序加以验证.结果 直接测序法检出16例(4.7％)阳性样本.标准质粒及克隆检测样本中缺失序列比例≥15％的样品,其熔解温度(Tm)≥88.3℃,遂将≥88.3℃作为新方法的阳性标准.用新方法检出47例(13.8％)阳性样本,其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例≥1.0％的样本38例,＜1.0％的样本9例;15份阴性样本缺失突变比例均＜1.0％.用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0％作为阳性阈值,新方法对nt1758-1777缺失检测的阳性符合率为80.9％,阴性符合率为100％,两种方法的一致性Kappa值为0.671.结论 与直接测序法相比,新方法可显著提高nt1758-1777缺失检出率,结合焦磷酸测序证实,可有效提高检测的准确性和经济性.该方法对建立,BV其他缺失突变的检测方法也可提供借鉴.     

60℃加热1小时灭活病毒方法对常规临床检测指标的影响研究

目的基于60℃加热1 h可有效灭活埃博拉病毒的观点,探讨用该条件加热处理对常规临床检测指标的影响。方法对40例受检者用枸橼酸钠抗凝管和EDTA-K2抗凝管分别采集静脉血,标本分为2份,检测未进行加热灭活处理(灭活前)和进行了加热灭活处理(灭活后)样本的生物化学、免疫、凝血和血常规指标,比较热灭活前后各指标的差异。结果与灭活前相比,灭活后样本的生物化学和免疫项目中总蛋白、总胆红素、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、钠、钾、氯、C-反应蛋白、尿素氮、葡萄糖、HBs Ab水平差异无统计学意义(P均0.05);白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶有较显著降低,但下降幅度不到80%且灭活前、后数据存在相关性(r0.80,P0.01),用回归方程校正后检测数据仍具有参考价值;碱性磷酸酶、γ-谷氨酰基转移酶、胆碱酯酶和肌酸激酶的测定值下降非常明显(P均0.01),且灭活前后2组数据无显著相关性。凝血检测项目中,D-二聚体在2组间的差异无统计学意义(P0.05);其余项目均受到热灭活严重影响。血常规项目中,血红蛋白、白细胞和血小板计数在2组间的差异无统计学意义(P0.05),但样本须要事先稀释。结论 60℃加热1 h灭活处理对部分生物化学、免疫和血常规项目无明显影响,部分项目检测值明显降低,但其中有6项指标经校正后仍具参考价值。     

HBsAg/HBsAb双阳性慢性乙型肝炎患者HBV S基因免疫逃逸相关变异分析

目的分析HBsAg/HBsAb双阳性慢性乙型肝炎患者HBV S基因主要亲水区免疫逃逸相关位点变异特点。方法收集89例HBsAg/HBsAb双阳性和148例HBsAg单阳性的慢性乙型肝炎患者血清及临床资料,提取患者血清HBV DNA,扩增患者HBV S基因并进行测序,应用DNASTAR Lasergene Meg Align软件对主要亲水区已有文献报道的46个免疫逃逸相关位点及新增N-糖基化变异进行比对分析。结果 2组患者在年龄、ALT、TBIL、HBV DNA载量和HBe Ag阳性率方面差异均无统计学意义(P均0.05)。HBsAg/HBsAb双阳性患者HBV S基因主要亲水区变异的总检出率为31.46%,明显高于HBsAg单阳性患者的18.92%(P0.05),其中s L110I/S、s T113N/S、s T131I/N/P和s S143L/M/T的变异检出率明显高于单阳性组;双阳性患者多位点联合变异检出率亦明显高于单阳性患者(20.22%vs.6.08%,P0.05)。双阳性患者新增N-糖基化变异检出率高于单阳性患者(7.87%vs.2.03%),差异具有统计学意义(P0.05)。结论 HBsAg/HBsAb双阳性患者比HBsAg单阳性患者的HBV S基因免疫逃逸相关变异种类更多,单位点和多位点联合变异检出率更高,并且新增N-糖基化变异检出率也更高,这些变异可能是引起慢性乙型肝炎患者HBsAg/HBsAb双阳性共存的驱动因素之一。     

肝脏组织学检查在慢性乙型肝炎患者管理中仍具有重要意义

正肝组织学检查不仅能够评价肝脏的炎症活动度和纤维化程度,还能够观察肝脏原位淋巴细胞、HBV特异T细胞等肝脏特有的免疫病理特征,以及肝细胞原位的HBV表面抗原、核心抗原的表达和亚细胞定位、共价闭合环状DNA(cccDNA)定量检测等病毒学特征。近年来,反映肝脏cccDNA水平和转录活性的新的血清学标志物和用于肝脏纤维化评估的血清学标志物、瞬时弹性成像(TE)等在慢性乙型肝炎(CHB)诊治中的应     

北京地区37例流感患者的病毒遗传变异及耐药突变分析

目的 分析2013-2014年度北京地区A型H1N1、H3N2和B型流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传变异情况,以及流感病毒对金刚烷胺类和NA抑制剂类(NAIs)抗病毒药物的耐药变异情况.方法 从37例流感病毒感染患者的鼻/咽拭子样本中提取RNA,采用荧光定量PCR检测流感病毒的基因型/亚型;反转录PCR方法扩增A型流感病毒的NA和基质蛋白M2(M2)基因片段及B型流感病毒的NA和血凝素(HA)基因片段,直接DNA测序.采用Mega软件构建系统进化树分析病毒的演变情况,Vector NTI软件分析耐药变异情况.结果 37例患者中共检出A型流感病毒29例,其中H1N1 23例,H3N2 6例;B型流感病毒8例.所有A型流感病毒均发生M2基因S31N金刚烷胺类药物耐药位点变异.A型和B型流感病毒均未发现NAIs耐药位点变异.系统进化分析显示,B型流感病毒有5例样品NA基因和HA基因分型不一致,NA基因均为B-Victoria系,而HA基因为B-Yamagata系.结论 北京地区人群A型流感病毒均对金刚烷胺类药物耐药,但A型和B型病毒均未检测出NAIs耐药变异.B型流感病毒流行株中存在B-Yamagata系和B-Victoria系重组病毒株.     

新型血清学标志物在不同类型乙型肝炎病毒感染中的检出特征分析

目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)新型血清学标志物HBVRNA、HBV核心抗原相关抗原(HBcrAg)、HBV核心抗体(anti-HBc)及肝组织HBV总DNA(tDNA)、共价闭合环状DNA(cccDNA)在不同类型HBV感染中的检出特点。方法 纳入2017年1月-2019年12月在解放军总医院第五医学中心住院并接受肝组织活检的227例不同疾病类型的HBV感染患者,回顾性分析其临床资料,检测其血清HBVRNA、HBcrAg、anti-HBc定量及肝组织HBVtDNA、cccDNA水平,比较分析各指标的特征以及抗病毒治疗对其的影响。结果 在16例急性乙型肝炎(AHB)患者中,HBV RNA检出率为25.0%(4/16),HBcrAg检出率为93.8%(15/16),肝组织HBV tDNA及cccDNA检出率分别为87.5%(14/16)及81.3%(13/16)。在184例慢性乙型肝炎(CHB)患者中,34例接受核苷(酸)类似物(NAs)治疗,其HBVRNA和HBcrAg定量均明显低于未治疗组,anti-HBc定量明显高于未治疗组(P<0.05)。在18例肝硬化(LC)患者中,9例...     

2种实时荧光定量聚合酶链式反应法检测HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA的一致性分析

目的 评价S（Shengxiang）公司、X（Xinbo）公司两种实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）方法定量检测HBV RNA结果的一致性。方法 从2007年7月—2008年8月组建的108例慢性乙型肝炎（CHB）前瞻性随访患者队列中,选取HBeAg血清学转换患者20例进行1∶1倾向性评分匹配未转换患者20例,采用S公司和X公司两种real-time PCR定量检测方法,回顾性检测基线、12周、24周及48周血清样本HBV RNA。符合正态分布的计量资料组间比较采用配对t检验;不符合正态分布的计量资料组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用χ²检验。通过Pearson相关系数、组内相关系数（ICC）和Bland-Altman法评价检测结果的一致性。结果 S试剂检测132份血清样本,X试剂检测154份血清样本,两种试剂对送检样本中HBV RNA检出率均为100%。两种试剂共同检测血清样本131份,在基线、随访12周、24周及48周分别检测34、29、35及33份血清,X试剂检测HBV RNA定量数据分别为（5.75±1.64、...