弓形虫ROP31基因克隆及生物信息学分析

目的构建弓形虫ROP31基因重组真核表达载体,对其编码的蛋白进行生物信息学分析。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,采用PCR扩增ROP31基因,构建其真核表达载体pET30a-ROP31。通过生物信息学软件结合在线程序分析ROP31基因编码蛋白的理化性质、抗原表位、空间结构等。结果 ROP31基因PCR扩增产物大小约1500bp,与预期一致,构建的重组质粒经双酶切鉴定表明目的基因插入正确。生物信息学分析ROP31基因编码蛋白有多个磷酸化修饰位点,具备多个跨膜区域;二级结构和空间结构分析ROP31蛋白与ROP家族优秀DNA疫苗ROP5、ROP17、ROP18在结构上相似;IEDB在线程序及DNA MAN软件分析ROP31蛋白具备比SAG1更为优秀的线性T、B细胞表位。结论成功构建重组真核表达载体pROP31,生物信息学分析其编码的ROP31蛋白具备优秀的细胞表位,这将为弓形虫ROP31DNA疫苗的研究提供理论依据。     

miR-422a靶向激肽释放酶-4抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移与侵袭

目的 探讨miR-422a靶向激肽释放酶-4（KLK4）对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 实时荧 光定量PCR法（qPCR）检测人宫颈癌细胞HeLa、SiHa和人正常宫颈上皮细胞H8中miR-422a的表达;将宫颈癌HeLa 细胞分为 blank 组、miR-NC 组、miR-422a 组、mut miR-422a 组、miR-422a+pcDNA 组、miR-422a+pcDNA-KLK4 组。 CCK-8实验和Transwell实验检测各组宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的能力;TargetScan软件预测miR-422a可 能调控结合的靶基因,双荧光素酶活性实验对靶向关系进行验证。Western blot检测各组细胞KLK4蛋白表达水平。 结果 与人正常宫颈上皮细胞H8相比,宫颈癌HeLa、SiHa细胞中miR-422a呈现低表达（P＜0.01）,选择宫颈癌HeLa 细胞进行后续实验;与miR-NC组和blank组相比,miR-422a组培养4、6 d细胞增殖能力降低,培养6、12 h细胞迁移 和侵袭数量减少（P＜0.05）;与miR-422a+pcDNA组相比,miR-422a+pcDNA-KLK4组培养4、6 d细胞增殖能力明显 升高,培养6、12 h细胞迁移和侵袭数量增加（P＜0.01）。TargetScan软件预测发现KLK4基因与miR-422a存在结合位 点,并经双荧光素酶报告基因实验验证。与 miR-NC 组相比,miR-422a 组中 KLK4 蛋白的表达水平降低,与 miR- 422a 组相比,mut miR-422a 组中 KLK4 蛋白的表达水平升高（P＜0.01）,与 miR-422a+pcDNA 组相比,miR-422a+ pcDNA-KLK4组中KLK4蛋白的表达水平升高（P＜0.01）。结论 miR-422a可通过靶向KLK4蛋白的表达抑制宫颈 癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

TgMAPK1核酸疫苗对小鼠的免疫保护性研究

目的构建重组质粒pEGFP-MAPK1,制备弓形虫MAPK1核酸疫苗(DNA疫苗),评价该疫苗在小鼠体内引起的免疫效应以及在抗弓形虫感染过程中的保护作用。方法以弓形虫RH株cDNA作为PCR的模板扩增目的基因TgMAPK1,与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组质粒pEGFP-MAPK1。pEGFP-MAPK1转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察及Western blot检测其在真核细胞内的表达情况。将BALB/c雌性小鼠随机分成3组(PBS对照组、pEGFP-C1对照组和pEGFP-MAPK1实验组),大提质粒并免疫接种每组小鼠,ELISA检测每组小鼠在免疫接种前后血清抗体和脾细胞培养上清中细胞因子的变化。将弓形虫速殖子经腹腔注射入小鼠体内并每天记录小鼠的存活时间,评价该疫苗诱导产生的免疫保护效果。结果 PCR扩增出约1 599bp的目的基因片段,重组真核质粒pEGFPMAPK1构建成功。重组质粒和空质粒转染的细胞在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光,提取的细胞总蛋白经Western blot检出能与相应抗体反应的分子质量单位约为58×103的目的蛋白。pEGFP-MAPK1免疫组小鼠较对照组能诱导产生更高水平的IgG(A值0.75~0.79)、IgG2a(A值0.65~0.71)和IFN-γ(725.67±23.25)pg/ml,差异有统计学意义(P0.05),而IgG1、IL-4和IL-10各组间差异无统计学意义(P0.05)。与对照组(6d)相比,pEGFP-MAPK1组小鼠(18d)感染弓形虫后的存活时间显著延长(P0.05)。结论 TgMAPK1核酸疫苗能诱导小鼠产生较强的体液免疫反应和Th1型细胞免疫反应,表明该疫苗具有一定的抗弓形虫感染免疫保护作用,TgMAPK1蛋白可作为弓形虫疫苗候选抗原。     

衢州市HIV抗体初筛阳性样本确证结果分析

目的分析衢州市2014—2016年HIV抗体初筛阳性样本的确证结果。方法对2014—2016年HIV抗体初筛阳性的529份样本,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和胶体硒法进行复检,复检阳性样本采用蛋白免疫印迹法(WB)进行确证,对确证结果进行描述性分析。结果 529份HIV抗体初筛阳性样本,复检阳性422份,阳性率为79.77%。422份复检阳性样本中确证HIV-1抗体阳性385份,占91.23%;HIV抗体阴性22份,占5.21%;HIV抗体不确定15份,占3.55%。对15份不确定样本进行随访,失访6份,阳转7份,阳转率为77.77%(7/9)。疾控机构、监管机构、医疗机构和采供血机构送检样本的复检阳性率分别为91.28%、95.55%、79.23%和26.41%,确证阳性率分别为96.06%、97.67%、89.30%和35.71%,不确定率分别为1.12%、2.32%、3.20%和42.85%。结论 HIV抗体筛查试验存在假阳性,同时应重视不确定结果受检者的随访。