改进的亚硫酸氢钠测序法检测HepG2 RASSF1A基因CpG岛甲基化状态

目的 改进亚硫酸氢钠测序法，并检验改进后方法在甲基化检测中的可行性。方法 提取人肝癌细胞株HepG2基因组DNA，亚硫酸氢钠化学修饰，针对修饰后Ras相关家族1A基因（RASSF1A）启动子序列设计特异引物并结合沉降PCR扩增，T-A载体克隆、测序。结果 HepG2细胞RASSF1A基因启动子CpG岛的16个CpG位点均被甲基化。结论 改进后亚硫酸氢钠测序法能明显减少非特异性扩增，提高PCR效率，更适于基因甲基化状态的检测。     

卡托普利对各期高血压左室肥厚的影响

卡托普利对各期高血压左室肥厚的影响滨州医学院附属医院（２５６６０３）孙为了解卡托普利对各期高血压左室肥厚（ＬＶＨ）的影响，我们对４０例患者进行了观察，现报告如下。临床资料：本组均按１９７８年ＷＨＯ制定的高血压标准确诊。平均年龄４６．７±３．３岁。高血...     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应（PCR），并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7，提取基因组DNA，利用亚硫酸氢盐测序法，用常规、降落及改进PCR分别扩增，比较扩增效果，PCR产物纯化回收后，TA克隆入载体pGEM-T，转化大肠杆菌（E．coli DH5α），筛选阳性克降，经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒，测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比，扩增效率增高，二聚体及非特异性扩增减少；测序结果显示，MCF-7细胞基因组DNA中，RASSFIA基因启动子CpG岛是高甲基化的，E-cadherin基因启动子CpG岛末呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性，更适用于基因甲基化状态的检测，并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

配体活化多环芳烃受体与二恶英反应元件结合能力的测定

目的 :2 ,3,7,8-四氯化二苯并二恶英 (TCDD)激活细胞溶质中多环芳烃受体后形成的复合物可与含二恶英反应元件的DNA探针结合 ,本研究利用新建立的外切酶保护PCR方法测定此结合亲和力 ,为评估配体的生物或毒效应提供依据。方法 :将 2 0nmol/LTCDD溶液与 10 0 μlSD大鼠肝细胞溶质温育 ,再与 0～ 15nmol/L含二恶英反应元件的寡核苷酸探针作用形成复合物 ,用核酸外切酶Ⅲ和S1核酸酶进行消化后 ,利用SYBRGREEN荧光适明定量PCR测定其诱导产生的结合DNA含量 ,绘制饱和曲线。经过数学变换估算配体—AhR复合物与DNA结合反应的宏观解离常数 (Kd和最大受体结合量 (Bmax)。结果 :绘制出TCDD活化AhR结合DNA的饱和曲线 ,计算得 :宏观解离常数Kd值为 1. 7± 0 . 2 (nmol/L) 2 ,DNA探针的最大受体结合量为 (14 6 7± 12 3)fmol/mg蛋白。结论 :外切酶保护PCR分析可测定配体诱导产生的AhR -DNA结合活性 ,为二恶英作用强度提供信息。     

良恶性肝病C-erbB-2和p53基因表达比较

目的　了解癌基因ＣｅｒｂＢ２ 和Ｐ５３ 在良恶性肝病中的表达情况,分析其在肝细胞癌癌变过程中发生的作用．方法　用ｃＤＮＡｍ ＲＮＡ 原位杂交技术和免疫组化对２２ 例肝硬变,１１ 例癌前病变、即肝小细胞非典型增生,３５ 例肝癌及５ 例正常肝组织进行检测．结果　ＣｅｒｂＢ２ ｍ ＲＮＡ 的杂交阳性率在正常肝、肝小细胞非典型增生、肝硬变、分化较好肝癌组和分化较差肝癌组分别为０ ,７３ ％ ,６４ ％ ,３７ ％ 和２５ ％ ;ＣｅｒｂＢ２ 蛋白阳性率分别为０ ,１００ ％ ,８２ ％ ,４５ ％ 和２９ ％ ． Ｐ５３ ｍ ＲＮＡ 的杂交阳性率在正常肝、肝小细胞非典型增生（ＳＬＣＤ） 、肝硬变、分化较好肝癌组和分化较差肝癌组分别为０ ,７３ ％ ,６８ ％ ,３６ ％ 和２５ ％ ;Ｐ５３ 蛋白阳性率分别为０ ,０ ,０ ,２７ ％ 和４２ ％ ． 蛋白阳性物只见于肝癌细胞．结论　ＣｅｒｂＢ２ 癌基因可能在肝癌癌变的早期阶段起作用,主要作用于ＳＬＣＤ、胆管细胞、增生肝细胞． 野生型Ｐ５３ 有抗癌作用,突变型Ｐ５３ 致癌作用可能发生于肝癌癌变较晚阶段．     

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的 建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法 选择单增李斯特菌特异性的基因Listeriolysin O基因为靶目标设计引物，采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株（1／2a）DNA，建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系：结果 定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号，对其他菌（大肠杆菌）无响应。标准曲线的相关系数为0．9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位／反应体系。在人为污染牛奶检测中，与传统细菌计数方法结果相比，相关系数为0．839。结论 实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法，可用于牛奶样品的检测。     

食品中非致病菌向致病菌转化机制研究进展

食品中的细菌根据其致病性可以分为致病菌、条件致病菌和非致病菌3类.凡能引起人类疾病的细菌,统称为病原菌或致病菌;条件致病菌指在机体抵抗力低下的条件下致病而正常健康状况下不致病的细菌;非致病菌是指食品中存在的非直接引起人体疾病的微生物.同一种细菌[1-5]在经历了一定时间演化后.其致病能力会发生改变.食品中越来越多的非致病菌进化成致病菌.本文对食品中非致病菌向致病菌转化机制作一综述.     

一种新的酶切保护PCR分析方法及其在二恶英类化合物检测中的应用

背景与目的:建立一种灵敏、快速、无放射性污染的生物方法来检测环境样本中的二恶英类化合物.材料与方法:二恶英类化合物可以活化胞浆内芳香烃受体(AhR)使之与一段包含特定序列的双链DNA结合,结合的DNA因受蛋白质保护可抵抗核酸外切酶消化而保留下来,痕量的保留DNA通过PCR检测出来.根据此原理本研究将TCDD溶液加入到含AhR及相关蛋白的细胞溶质中,在体外与含二恶英反应元件的DNA作用形成二恶英-AhR-DNA复合物,用核酸外切酶Exo Ⅲ和S1核酸酶进行消化后作PCR,通过琼脂糖电泳可以检测目的DNA是否存在;同时以有机溶剂DMSO设为对照.结果:在实验组用琼脂糖电泳可以检测到期望大小片段的DNA,而对照组为阴性.结论:该方法可作为环境样本中二恶英污染的生物检测手段,具有灵敏、经济和快速的优点.     

二恶英类化学物质生物检测方法研究进展

应用生物检测手段(如生物法、免疫测定及体外受体结合实验等)检测环境污染物是环境检测领域一个研究热点,特别在二恶英类化合物的痕量分析中的作用令人瞩目。本文综述了用于二恶英类化合物筛选的几类生物检测方法的原理和优缺点,对各种方法进行了比较,指出建立二恶英两级检测的体系的合理性以及发展方向。     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应(PCR),并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌(E.coliDH5α),筛选阳性克隆,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF lA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。