《金匮要略》线上线下混合式教学模式建设历程与体会

《金匮要略》的学科属性决定了其教学应是传统与现代教学模式的融合。湖南中医药大学《金匮要略》线上线下混合式教学历经10年建设,边建设边实践,通过实践来验证并改进教学模式,多维度线上资源与多元化线下课程有机融合为整体,教学实践初见成效。构建更科学与全面的形成性评价模式是下一步的重要建设任务。     

左归降糖舒心方调控自噬对糖尿病转基因MKR鼠心肌损伤的影响

目的 通过观察左归降糖舒心方对骨骼肌胰岛素样生长因子1及胰岛素双受体功能缺失(mouse overexpressing a dominant-negative IGF-I receptor specifically in muscle,MKR)糖尿病心肌病小鼠的自噬标志蛋白Beclin-1表达的影响,研究调控自噬水平对糖尿病心肌损伤的保护作用机制。方法 C57 BL小鼠设作正常组,普通饲料喂养,MKR小鼠采用高脂饲养(high-fat diet,HFD)联合多次链脲佐菌素(streptozocin,STZ)腹腔注射造模后,随机分为模型组、左归降糖舒心方组(中药组)、雷帕霉素组、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)组、盐酸二甲双胍片+马来酸依那普利片组(西药组),药物干预28 d。记录小鼠一般情况及空腹血糖(fasting blood glucose,FBG);ELISA检测肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes,CKMB)以评价心肌损伤程度;透射电镜观察心肌形态结构的改变及...     

黄芪桂枝五物汤通过调节内质网应激对MKR小鼠糖尿病周围神经病变的作用

目的 探讨黄芪桂枝五物汤通过调控内质网应激c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路相关蛋白治疗糖尿病周围神经病变的作用机制。方法 8周龄骨骼肌特异性胰岛素样生长因子-1受体功能缺失小鼠（MKR小鼠）32只，雌雄各半，予高脂饲料喂养4周后，1%链脲佐菌素（STZ）连续腹腔注射5 d；血糖稳定后，每天将小鼠放入铺满冰袋的喂养笼，使其在冰上活动1 h，持续4周。将空腹血糖值≥11.1 mmol·L^-1的小鼠随机分为模型组、黄芪桂枝五物汤原方剂量组（30 g·kg^-1·d^-1）、黄芪桂枝五物汤方剂学剂量组（6.25 g·kg^-1·d^-1）、阳性药物（甲钴胺）组（0.17 mg·kg^-1·d^-1）。另设同龄MKR鼠8只作为空白组；FVB鼠8只作为正常组。各组灌胃药物4周后，测定小鼠空腹血糖（FBG）的变化，苏木素-伊红（HE）染色和透射电镜对坐骨神经组织形态进行观察，免疫组化法、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测坐骨神经组织内质网应激相关蛋白JNK、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）与肌醇需求激酶1α蛋白（IRE1α）的表达变化。结果 小鼠行为学与功能学检测显示，与正常组和空白组比较，模型组小鼠缩足舔足、甩尾时间显著缩短（P<0.01），坐骨神经传导速度显著降低（P<0.01）；与模型组比较，黄芪桂枝五物汤处理后，能够明显改善小鼠行为学与功能学检测指标（P<0.05，P<0.01）。免疫组化结果显示，与正常组和空白组比较，模型组小鼠JNK的表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪桂枝五物汤处理后，JNK的表达明显降低（P<0.05），但给药组之间差异无统计学意义。Western blot结果显示，与正常组和空白组比较，模型组小鼠坐骨神经IRE1α、p-JNK蛋白表达有不同程度的明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，黄芪桂枝五物汤可以相应下调模型小鼠坐骨神经IRE1α、p-JNK蛋白表达含量（P<0.05，P<0.01）；原方剂量组与教材剂量组比较，差异无统计学意义。结论 黄芪桂枝五物汤可改善坐骨神经功能、减轻坐骨神经组织损伤，其机制可能与黄芪桂枝五物汤抑制坐骨神经的内质网应激反应水平有关。     

左归降糖益肾方含药血浆对高糖培养小鼠足细胞凋亡及Caspase-12表达的影响

目的 探讨在高糖作用下,体外培养的小鼠足细胞凋亡及内质网应激凋亡因子Caspase-12 mRNA和蛋白表达水平的变化及左归降糖益肾方含药血浆的调控作用.方法 将体外培养的小鼠足细胞随机分为空白组(A组,25 mmol/L葡萄糖,10％空白血浆)、高糖组(B组,200 mmol/L葡萄糖,10％空白血浆)、左归降糖益肾方含药血浆组(C组,200 mmol/L葡萄糖,10％含药血浆),4-苯基丁酸含药血浆组(D组,200 mmol/L葡萄糖,10％含药血浆).培养48 h后,采用免疫荧光细胞化学法、流式细胞术检测足细胞凋亡情况;Western blot法、RT-PCR法分别检测Caspase-12蛋白或mRNA表达水平的变化.结果 与A组比较:在高糖状态下B组足细胞凋亡率、Caspase-12 mRNA和蛋白的表达水平均升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与B组比较:C组、D组足细胞凋亡率,Caspase-12 mRNA和蛋白的表达水平均降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与C组比较:D组足细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P＜0.05);但Caspase-12 mRNA和蛋白的表达水平,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 Caspase-12表达上调,是足细胞凋亡的分子机制之一;10％左归降糖益肾方含药血浆可能通过降低Caspase-12的表达水平,从而保护足细胞.     

左归降糖舒心方含药血浆对ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞泡沫化和凋亡的影响

目的?探讨左归降糖舒心方含药血浆对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导巨噬细胞泡沫化和凋亡的影响及其作用机制。方法?将巨噬细胞J774A.1随机分为正常组、模型组、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）组、左归降糖舒心方含药血浆组、西药联合含药血浆组,每组5个复孔。除正常组外其余各组以ox-LDL（100?mg/L）处理构建巨噬细胞泡沫化模型。正常组和模型组正常培养,其余各组分别用10%相应含药血浆培养24?h。CCK-8法比较各组J774A.1细胞增殖情况,计算细胞抑制率;油红O染色检测细胞内脂质蓄积水平;Western blot检测双链RNA样内质网激酶（PEPK）、活化转录因子4（ATF4）、真核翻译起始因子2α（eIF2α）、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）及半胱氨酸蛋白酶蛋白-12（Caspase-12）的表达水平。结果?与正常组比较,模型组细胞抑制率增高,在ox-LDL浓度为100?mg/L时细胞抑制率为（50.06±0.09）%,有明显的脂质颗粒蓄积（P<0.01）。与模型组比较,各药物干预组细胞抑制率降低,可有效阻断ox-LDL的摄入及脂质堆积,其中左归降糖舒心方含药血浆组优于西药联合含药血浆组,与TUDCA组作用效应相当。ox-LDL可诱导细胞内质网应激相关蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP与Caspase-12表达上调。左归降糖舒心方含药血浆可显著抑制100?mg/L ox-LDL所致的p-PERK、p-eIF2α、ATF4的上调,降低内质网相关凋亡蛋白CHOP与Caspase-12的表达（P<0.01）,和TUDCA组作用相当(P＞0.05),其效果较西药联合含药血浆组明显（P<0.01）。结论?左归降糖舒心方含药血浆能有效改善ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化、细胞凋亡及内质网应激状态,其作用机制可能与调控内质网应激信号通路PERK/eIF2α/ATF4通路,降低细胞内CHOP与Caspase-12表达有关。      

茵陈蒿汤对MKR鼠2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的作用

目的 探讨茵陈蒿汤对MKR鼠2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的作用机制。方法 8周龄MKR小鼠40只高脂喂养8周后,随机分为模型组、茵陈蒿汤原方剂量组（17.16 g·kg^-1）,茵陈蒿汤教材剂量组（4.68 g·kg^-1）,二甲双胍+辛伐他汀组［（65+2.6）×10^-3 g·kg^-1）］,同龄MKR鼠10只作为空白组,FVB鼠10只分别作为正常组。各组灌胃给药8周后,测定小鼠肝脏湿重,口服糖耐量（OGTT）,血清炎性因子白细胞介素-6（IL-6）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,血脂和肝功能的变化,透射电镜和苏木素-伊红（HE）染色对肝脏组织形态进行观察,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝脏组织Toll样受体4（TLR4）,髓样分化因子88（MyD88）,核转录因子-κB（NF-κB）蛋白表达变化。结果 与模型组比较,给药组小鼠肝湿重指数显著降低（P<0.01）,OGTT较模型组明显有所改善（P<0.05）,血清中IL-6,TNF-α含量显著降低（P<0.01）,形态学改变上,茵陈蒿汤对肝细胞结构有保护作用,减少肝细胞脂肪样变性;茵陈蒿汤可以明显下调T2DM合并NAFLD模型小鼠肝脏组织TLR4,MyD88,NF-κB蛋白含量（P<0.05）,且对于TLR4,NF-κB的下调,茵陈蒿汤原方剂量明显优于茵陈蒿汤剂量（P<0.05）。结论 茵陈蒿汤能降低炎症因子水平,肝组织TLR4,MyD88,NF-κB的表达水平,改善肝脏病理损伤,干预MKR鼠T2DM合并NAFLD疾病状态,具有一定保护肝功能,降低血脂以及延缓肝脏炎症反应的作用。     

参苓白术散调控TLR4/NF-κB通路抑制LPS诱导心肌细胞炎性损伤的机制

目的 基于Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)/核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路探讨参苓白术散含药血清对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导H9C2心肌细胞炎性损伤的调控机制。方法 将分化完全的H9C2心肌细胞分为空白血清组、模型组、参苓白术散含药血清组、TLR4抑制剂（TAK-242）组,每组6个复孔。除空白血清组外,其余各组以10μg·m L-1 LPS处理细胞,构建心肌细胞炎症损伤体外模型。空白血清组、模型组及TAK-242组以10%空白血清进行培养,参苓白术散含药血清组用10%含药血清培养,均培养24 h。采用CCK-8法测定各组细胞增殖情况;采用ELISA法及免疫荧光法检测细胞白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)含量及蛋白表达水平;采用Western blot法检测TLR4、NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(degradation of proteinκB-α, IκBα)...     

左归降糖清脂方对2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病MKR鼠Visfatin信号分子的影响

目的 探讨左归降糖清脂方对2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病MKR鼠内脂素（Visfatin）信号分子的影响。方法 8周龄MKR小鼠,按性别、空腹血糖、体质量随机分为空白组、模型组、中药组、阳性药物组;同龄C57/BL/6小鼠作为正常组;每组16只。除正常组、空白组外,其余小鼠高脂饲养8周。中药组予左归降糖清脂方溶液29.6 g/kg,阳性药物组（二甲双胍和辛伐他汀组成,比例为50∶1,给药67.6 mg/kg）,其余组予等体积蒸馏水（体积同中药组）,灌胃治疗8周。心脏采血处死各组小鼠,采用电化学法检测空腹血糖;常规生化法检测肝功能、血脂;电镜及HE染色观察肝组织形态结构及病理变化;实时荧光定量检测肝脏脂肪组织分泌激素类代谢调节因子Visfatin、视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein4, RBP4)的mRNA表达水平;酶联免疫法检测血清炎症因子血清可溶性白细胞介素-2受体(soluble interleukin-2 receptor, SIL-2R）、成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2, FGF2)含量的变化。结果 与正...     

左归降糖舒心方调控TLR4/NF-κB通路抑制糖尿病心肌病小鼠心肌纤维化的机制研究

目的 基于Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路探讨左归降糖舒心方对糖尿病心肌病MKR小鼠心肌纤维化及炎症因子的影响。方法 以8周龄雄性MKR小鼠为实验对象,采用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）40 mg/kg构建糖尿病心肌病模型,随机分为中药高剂量组[33.67 g/（kg·d）左归降糖舒心方2 g/mL]、中药低剂量组[16.84 g/（kg·d）左归降糖舒心方2 g/mL]、西药联合组[0.23 g/（kg·d）二甲双胍联合1.5 mg/（kg·d）依那普利]和模型组（等容量蒸馏水）;另设FVB小鼠为空白对照组（等容量蒸馏水）。每组10只,连续给药8周后取材。收集尾静脉血液检测空腹血糖水平;采用HE、Masson染色观察心肌病理改变,电镜观察心肌组织超微结构变化;采用ELISA检测小鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)含量;采用Wes...